A族链球菌诱导细胞自噬机制研究.pdf

目 录 中文摘要………一……………．……………………．．1 英文摘要…………………．．．…．．……………………4 英文缩写……．…．．………．．．………………………．．8 研究论文A族链球菌诱导细胞自噬机制的研究 前言……．．………………………．．……………．．9丹IJ舌……．．………………………．．……………．．9 材料与方法………………………………………．．10 结果……………………………………．………．28 附图……………………．………………………．30 附表……．………．．……．．…．…………………．．35 讨论．……．……………．．．．……………………．．36 结论………………………．．．…………………．．38 参考文献．……．．…………………………………．39 综述细胞因子与自噬的相互作用……．…………………．．43 致谢……………………．．．………………………．．53 个人简历……．………………………………………54 万方数据 中文摘要 A族链球菌诱导细胞自噬机制的研究 摘 要 的双层膜，包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自 的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器更新的基础代谢过程。 研究表明，多种因素诸如氧化应激、饥饿、高温、细胞内损伤、细菌病毒 感染等，都会诱发细胞自噬。细胞自噬对于机体正常稳态有重要意义：饥 饿应答进程中，在不同的器官如肝脏或培养细胞，由于氨基酸的匮乏，会 诱导自噬，后者分解大分子，’以产生分解代谢和合成代谢过程中所必须的 中间代谢物；在细胞正常活动过程中，如在动物的变态发育、老化和分化 过程中，自噬负责蛋白降解以重建细胞。 A族链球菌(GAS)是一类革兰氏阳性球菌，人类约90％的链球菌感 染是由GAS引起的。感染GAS后可引起化脓性疾病，如局部皮肤及皮下 组织感染等，中毒性疾病如猩红热等，变态反应性疾病如风湿热、急性肾 小球肾炎等。GAS较强的侵袭力主要取决于其能产生多种胞外酶及毒素， acid，LTA)、M蛋白(M 例如脂磷壁酸(1ipoteichoic protein)、致热外毒 素(pyrogenic 有其各自功能，例如脂磷壁酸可以增强细菌对宿主细胞的粘附性；M蛋 白是GAS的主要毒力因子；致热外毒素能改变血脑屏障的通透性；溶血 素分为链球菌溶血素O和链球菌溶血素S，在链球菌引起超敏反应的过程 中起着重要作用。在机体受到GAS入侵时，是否会发生细胞自噬；如果 发生，那么GAS诱导细胞自噬的机制是什么?这些问题目前尚不清楚。 本研究通过western 方法检测LC3蛋白的细胞原位表达变化来探究GAS全菌及其缺陷菌株是 否诱导细胞发生自噬。而后，用纯化的M蛋白，FbaA蛋白刺激Hep2细 胞以验证其在诱导自噬中的作用。接下来进一步用本室保存的分段蛋白刺 万方数据 中文摘要 激细胞，以寻找GAS诱导自噬发生的具体蛋白区段。 方法： A549作为对照组，在侵袭细胞后，根据渗透压原理得到胞内菌，不同倍 数稀释后涂于血平板培养基上，计算GAS的侵袭效率。 FbaA+M—GAS缺陷菌株刺激，用western blot检测自噬相关蛋白LC3，P62 在不同时间点的表达变化。 4．应用亲和层析法纯化FbaA蛋白，M蛋白。 blot检测自噬相 5．Hep2细胞分别接受两种蛋白的刺激后，用western 关蛋白LC3，P62在不同浓度和不同时间点的表达变化。 blot检测自噬相关蛋白LC3，P62在不同浓度和不同时间点的表达变化。 结果：