绿色荧光蛋白定点突变的新型T载体构建及研究.pdf

摘要 TA 克隆是最简洁、高效的克隆PCR 产物的方法之一，在没有合适的酶切位点来 进行载体间的DNA 片段亚克隆时尤其有用。T 载体具有3‟末端单一的T 凸出尾，使 其能够直接与3‟端具有A 凸出尾的PCR 产物高效连接。常用T 载体的不足之处在于 需要IPTG 诱导和X-gal 显色剂，例如蓝白斑筛选；或者菌株生长不稳定，如利用毒 蛋白或杀菌肽构建的T 载体。最近绿色荧光蛋白(GFP)被用于构架T 载体的筛选试剂， 插入片段和T 载体的重组菌落可以在可见光下进行鉴定，但是仍然需要IPTG 诱导。 本实验使用一种新型 GFP 突变体Emerald 作为细胞荧光指示剂，构建新型灵敏的 T 载体。主要结果如下： 1、定点突变：定点突变绿色荧光蛋白突变体EGFP(F64L–S65T– H231L)，获得4 个氨基酸残基突变的Emerald 突变体(S72A, N149K, M153T 和I167T) 。 2 、胞外分析：构建大肠杆菌Emerald 的表达载体p28SUMO-emerald 。表达并纯 化重组蛋白Emerald，并分析其紫外可见光谱和荧光扫描光谱性质与报道一致。重组 Emerald 在 Hampton Screen Ⅰ Ⅱ的第 39 号条件：2 mol/L(NH ) SO ，0.1 mol/L 4 2 4 HEPES-NaOH , pH 7.5, 2% PEG400 中晶体生长最优，为柱状晶型。 3、胞内分析：Emerald 基因连入pUC18 载体后，上游添加增强子以增强表达效 果，在不加IPTG 和X-gal 的条件下， 37℃培养18 小时，大肠杆菌重组菌落在可见 光下显示绿色。添加增强子后，菌液每毫克上清总蛋白荧光强度提高至原来的3.3 倍。 4 、同义突变：根据GFP 的三维结构预测结果，分别在Emerald 突变体第4 和第 5 个β 折叠片层结构上选择了2 个突变位点，即第93 位的V 和第109 位的R，分别 创建SnaB Ⅰ和Sma Ⅰ酶切序列。 5、T 载体构建及验证：构建p ESN-T 和pESM- T 载体。将约500bp 外源PCR 片 段分别与两种T 载体连接，重组菌斑为白色，对照在可见光下为绿色。 6、插入突变：为了验证T 载体的灵敏性，利用定点突变的方法分别在pESN 和 pESM 载体的SnaB Ⅰ和Sma Ⅰ酶切位点识别序列中间添加一个三核苷酸序列 TCC 。 平板转化以及菌液上清总蛋白荧光强度分析显示绿色荧光消失，插入突变后的 Emerald 蛋白在包涵体中表达，折叠性和表达量均受到大幅度影响。 综上所述，本文研究了绿色荧光蛋白突变体 Emerald 在大肠杆菌胞外和胞内性 质，选取两个限制性内切酶位点SnaB Ⅰ和Sma Ⅰ作为插入位点构建T 载体，并构建 插入一个三核苷酸序列TCC 的突变载体，转化后菌落荧光强度几乎为零，蛋白表达 量以及折叠性均大幅度下降。本研究构建的T 载体目前最灵敏，具有良好的应用价值。 关键词：绿色荧光蛋白，晶体生长，T 载体，大肠杆菌，菌落绿色荧光 I Abstract The TA cloning technique is one of the simplest and most efficient methods for the cloning of PCR products, and it is especially useful when compatible restriction sites are not available for sub cloning . DNA fragments from one vector into another. A T-vector contains a single T extension at the 3‟ terminal that permits efficient ligation of cloning PCR products hav