二甲基精氨酸二甲胺水解酶2重组蛋白纯化及其功能的研究.pdf

摘要 研究背景和目的心血管疾病是严重危害人类健康的常见病。一氧化 氮介导的内皮依赖性血管舒张反应降低是大多数心血管疾病的早期病理 表现。大量研究表明，内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物一非对称性二 甲基精氨酸(ADMA)是导致血管内皮功能不全的重要物质。二甲基精氨 的组织，后者则主要分布于表达内皮型NOS的心血管组织；因此，DDAH2 是决定心血管系统ADMA含量的关键因素。但目前尚无直接增加DDAH2 Tat 表达和活性的药物。近年来发现一种来源于人类免疫缺陷病毒HIV．1 (Trans．activator (Proteintransduction domain)，能有效地引导肽段或蛋白质进入细胞， 具有蛋白传送功能。因此，本课题将TatPTD区段融合于人DDAH2蛋白 的N端，使DDAH2蛋白具备穿膜能力，定位于细胞内并发挥作用。在此 基础上，用多种心血管的危险因子如高糖、同型半胱氨酸、游离脂肪酸如 述因素对DDAH活性的抑制，从而为大规模开发可应用的重组蛋白产品 奠定技术基础，为心血管疾病防治拓开新途径。另一方面，用重组的 的检测。 I和BamH 然后再分别用Sal 大肠杆菌BL21体内诱导表达，并通过优化诱导条件提高目的基因的原核 表达水平和可溶性融合蛋白的含量。②重组Tat．hDDAH蛋白的纯化：将 包涵体形式的重组蛋白溶于8mol／L的尿素溶液中，然后经过复性、透析 脂糖珠(Glutathione4B)充分混匀，经过GlutathioneSepharose Sepharose 钠溶液洗涤后得到较纯化的包涵体，并将其作为抗原与佐剂充分乳化后经 皮下注射免疫新西兰大白兔，制备抗DDAH2的多克隆抗体，并用ELISA、 western 蛋白表达的检测。④重组Tat．hDDAH2蛋白的功能实验：培养人脐静脉 内皮细胞系HUVEC．12，分别用心血管疾病的危险因子高糖、同型半胱氨 16～48 acid，PA)孵育HUVEC．12h， 酸、游离脂肪酸如棕榈酸(palmitic 害。 结 果 ① 经PCR、酶切及测序鉴定，原核表达载体 建成功；并转化BL21大肠杆菌诱导表达，通过筛选不同的诱导条件，发 现用较低的IPTG浓度(O．05 诱导时间(8 ml 粒的细菌培养液于1200040c离心10min，去上清，将细菌用100 rpm PBS重悬；经超声裂解后于1200040c离心10min，分离上清中的可 rpm 溶性融合蛋白与包涵体；将包涵体变性、复性后，分别将包涵体中复性的 融合蛋白和上清中可溶性的融合蛋白经Glutathione4B亲和吸 Sepharose 附，得到纯化的GST-Tat．hDDAH2融合蛋白2．169 mg和纯化的 GST-hDDAH2融合蛋白2．571 1．362 mg的Tat-hDDAH2重组蛋白和1．469 1～2)。③用含GST-hDDAH2蛋白的包涵体免疫新西兰兔，10W后用乌 拉坦(O．8 min 40C离心10 g／l(g，i．v．)麻醉，经颈动脉插管取血，3000rpm Ⅱ 分离血清，加入终浓度为0．02％的