显微技术第六章原位杂交组织化学技术.ppt

核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。 核酸杂交 原位杂交属于固相核酸分子杂交的范畴，但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术： 菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交； 斑点杂交是检测特定的DNA片段； Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段； Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定RNA片段； 分子杂交技术 分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。 原位杂交组织化学技术(in situ hybridization histochemistry；ISHH) 简称原位杂交,是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 核酸分子杂交除了能在变性的单链DNA间进行外，在DNA与RNA间、RNA与RNA间，以及寡核苷酸与DNA或RNA间也可通过碱基配对(A-T、、C—G、A—U)实现分子杂交。因此，核酸分子杂交所用的探针种类可以是DNA、RNA或寡核苷酸。探针的标记物常用的有放射性核素和非放射性核素性化学物质两大类。其作用在于杂交后辅以感光或化学反应，显示与探针互补的靶核酸(DNA或RNA) 三、原位杂交组织化学基本技术 由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为： ① 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； ② 杂交； ③ 杂交后处理； ④ 显示：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。 1.组织和细胞标本的准备 原位杂交技术可应用于冷冻或石蜡片、细胞培养片或细胞切片等。为了获得良好的杂交结果，组织和细胞标本的取材和处理是十分重要的，总的目的是既要充分保留被测核酸不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。其基本要求与免疫组织化学技术相似，即新鲜取材和及时固定 DNA的稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或细胞内DNA的原位杂交检测，即使长期保存的石蜡块也可用于回顾性研究。 但RNA非常容易降解．RNA酶在周围环境中几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。防止RNA酶污染及灭活RNA酶的方法有； ①标本尽早固定，组织固定剂可以灭活组织内的RNA酶； ②所用玻璃器皿均需经180℃处理3h以上，或用新鲜配制的0.1%二乙基焦碳酸盐(DEPC)水在室温中处理2—3h； ③所用试剂要用DEPC水配制并经高压消毒； ④所有操作都要带手套； ⑤各种反应过程中注意应用RNA酶抑制剂。只要充分注意以上各点，在石蜡切片上一样可以得到良好的RNA杂交结果，而石蜡切片的组织形态较冷冻切片好得多。 用于杂交的组织或细胞标本的固定剂与免疫组化相似，其中醛类固定剂应用最多，尤其是用4％多聚甲醛(用0.1mol/L PB配制)固定可以较好地保存组织中的靶核酸，组织形态结构的保存也优于沉淀类固定剂(如乙醇)，而且同时也适用于免疫组化染色。固定时，有两点需注意，一是尽量早期固定，另一是固定时间不能太长，最好采用4℃下固定，一般不超过24h(根据组织片的厚薄从30 min至24h)。 2.杂交前处理 杂交前处理是指从石蜡切片脱蜡到预杂交前的一系列过程。其主要目的是：①增强组织或细胞的通透性，以利于探针的穿透；②尽可能减少与探针产生非特异吸附的背景。采用的方法有： 2.1.蛋自酶消化 酶消化的应用不仅可以消除组织固定时产生的分子间交联对靶核酸造成的屏蔽作用，还有增加组织通透性和去除无关的杂蛋白的意义。蛋白酶消化对石蜡切片原位杂交结果的好坏具有非常重要的影响。常用的有蛋白酶K(proteinas。K)，此外还有胃蛋白酶(pepsin)、链霉蛋白酶(pronase)等。 各种酶的最佳作用通常要求37℃．且与反应溶液的pH值相关，如蛋白酶K和链霉蛋白酶在中性pH值下才能发挥最大的酶活力，而胃蛋自酶最大活力是在PH1.8—2.5之间，但是，消化酶的浓度、作用时间等参数的选择则应根据组织的类型、固定购程度，探针的大小、酶的批号和活性等作具体分析，经过多次预实验才能选定最佳方案。消化后