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* * 第七章 核酸分子杂交 核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异质双链的过程, 即来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交(hybridization)。具有灵敏度高、特异性强等优点，主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测。 第一节 核酸分子杂交的基本原理 第二节 核酸探针 第三节 核酸分子杂交技术 第一节??? 核酸分子杂交的基本原理 DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间，只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂交。常用已知的DNA或RNA的片段作为探针，包括特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列，或人工合成的寡核苷酸片段。 根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。 第二节 核酸探针 核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 一、核酸探针的类型 ㈠ 基因组DNA探针 用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编码序列(外显子)。 ㈡ cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，特异性高，是一种较理想的核酸探针。 ㈢ RNA探针 RNA探针有下述优点： ①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更高。 ②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性，杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。 ④杂交后用RNase消化未杂交的RNA探针，可降低杂交本底。 ㈣ 寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是由实验者设计、经核苷酸合成仪人工合成的。 1.探针制备方便，可以根据需要设计合成各种寡核苷酸片段，从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选特定的克隆。 2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱变技术产生的点突变。 3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针。 二、标记物 标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性。 ㈠ 放射性同位素 放射性同位素探针标记物，有高度特异性，缺点是易造成放射性污染，半衰期较短，不能长期存放。常用的有32P、3H、35S，有时也用14C、125I或131I。 ㈡ 非放射性标记物 (1)????? 半抗原 (2)????? 配体 (3)????? 荧光素 (4)????? 化学发光技术 三、探针放射性同位素标记法 ㈠ 放射性同位素的选择 32P、35S或3H均可用于标记DNA或RNA。32P最常用于核酸的标记。35S适用于原位杂交和DNA序列测定。3H放射比活度低，故常用于原位杂交。 ㈢ 放射自显影检测杂交信号 利用放射线在X线片的成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。这种方法的操作步骤如下： (1)???将滤膜用保鲜膜包好，置于暗盒中。 (2)?在暗室中，将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上，光面向上，压1~2张X线片，而后再压上增感屏后屏，光面向X线片，盖上暗盒，置于70℃，曝光适当的时间。 (3)?根据放射线的强度曝光一定的时间后，在暗室里取出X线片，显影定影。如曝光不足，可再压片重新曝光。 第三节 核酸分子杂交技术 在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持物上进行杂交则称为固相杂交。 固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类。固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合，从而获得清晰的杂交图谱，有利于定性或定量分析待测核酸样品中的特定片段(靶序列)，在核酸的结构和功能研究以及基因工程研究中，其应用比液相杂交更为广泛，其技术发展也更为迅速。 一、膜上印迹杂交 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。 ㈠ 滤膜杂交的基本过程如图7-8所示。 (1)????? 核酸的制备 (2)????? 电泳 (3)????? 印迹 (4)????? 预杂交 (5)????? 杂交 (6)????? 洗膜 (7)????? 检测 ㈡ 固相支持物的选择 一种良好的固相支持物应具备以下几个特点： (1)????? 具有较强的结合核酸分子的能力，一 (2)????? 与核酸分子结合后应不影响其与探针分子的杂交反应。 (3)????? 与核酸分子的结合稳定牢固， (4)????? 非特异性吸附少。 (5)????? 具有良好的机械性能。 下面介绍几种常用的固相支持物： (1)??硝酸纤维素膜：特别适用于