《mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制研究.》.pdf

中华细胞与干细胞杂志(电子版)2014~f~2E第4卷第1期ChinJCellStemCell(ElectronicEdition)，Feb2014，v01．4，No．1 ·29 · 论 著 · mTOR信号通路在 iPS定向分化RPE细胞中的 调控机制研究 蒋超 石厚霞 丁思加 赵晨 【摘要】 目的 探讨mTOR信号通路在 iPS定向分化 RPE细胞中的调控机制。方法 培养iPS细胞，悬浮培养后形成拟胚体 EB，诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的 方法，观察iPS．RPE细胞分化一个月后特异性蛋 白(RPE65、LRAT、ZO．1)的表达 。同时通 过Q—PCR，WesternBlotting的方法检测 iPS．RPE在不同分化时问点(分化 1个月、2个月、 3个月)上，iPS．RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最 后应用雷帕霉素抑制 iPS—RPE细胞 中mTOR的通路，进一步观察 iPS—RPE细胞中的蛋白 表达变化。Q．PCR采用单因素方差分析(One—WayANOVA)进行组间比较 。结果 荧光显 微镜观察到iPS—RPE细胞在分化 1个月时，表达 RPE65、LRAT、ZO．1蛋白。与对照组iPS 比较，Q．PCR结果显示，实验组 RPE65在分化 1个月，2个月，3个月时的表达量分别为 0．84士0．13，4．84-1．1，20．3-44．9(P=0．ooo)；Best1分化 1个月，2个月，3个月时的表达量 分别为 1．54-0．16，2．34-0．68，l1．78-41．57 =0．o00)；MerTK在分化 1个月，2个月，3个月 时的表达量分别为 4．12-41．94，1．87-40．76，15．53-41．33(尸=0．oo0)，CK18分化 1个月，2个 月，3个月时的表达量分别为 2．4-40．63，2．3-40．37，9．67-41．44(P=0．000)，WesternBlotting 结果也表明，随着分化时间延长，iPS—RPE细胞中特异性蛋 白(BEST1、catenin、MerTK)表 达量有显著提高，而 mTOR信号通路的活性受到抑制 。与对照组(加DMSO)比较，雷帕霉 素处理获得 的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK、ckl8蛋 白表达量上升不是很明显，catenin 蛋 白显著提高。结论 建立 了体外高等分化 、功能高效的iPS．RPE细胞，随 iPS—RPE细胞分 化时间延长 ，mTOR信号通路的活性是逐步抑制 的。 【关键词】潜能干细胞： 视网膜； 上皮细胞； 细胞分化； 信号通路 Themechanism ofmTOR signalingpathwayintheregulationofdifferentiationofiPSinto retinalpigmentepithelialceHsJiangChao，ShiHouxia,DingSijia,ZhaoChen．Departmentof Ophthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing21002~China Correspondingauthor．ZhaoChen，Emaihdr．zhaochen@gmail．com 【Abstract】ObjectiveToexploretheroleofmTORsignalingpathwayintheregulation ofdifferentiationofiPSintoretinalpigmentepithelial(RPE)cells．MethodsAfterembryoid bodieswereformedbyculturediPSinsuspensioncondition，theywereinducedtodifferentiate intoRPEcells．TheexpressionsofRPEspecificproteins(RPE65，LRAT，ZO一1)iniPS—RPE cellsduringdifferentiationweredetectedbyimmunocytochemistry。O．PCR andWestern BlottingwerecarriedouttoanalyzeRPE specificgenes，proteinsandmTOR