实验八重组子鉴定2008.pptVIP

实验八重组子鉴定 实验目的 了解转化子鉴定原理，掌握各方法适用的情况 酚/氯仿快速抽提、酶切鉴定上次实验的转化子 实验原理 基因组获得基因： 构建基因文库 筛选特定基因 得到经过鉴定的重组子才完成了一个完整的克隆过程 重组鉴定可从以下水平进行： DNA水平： 快速抽提酶切分析 原位杂交 Southern杂交 DNA顺序分析 mRNA水平： 蛋白质水平： 免疫沉淀检测法 功能水平： 抗性反应 显色反应 常用鉴定方法 小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析 ?互补 杂交筛选  酚/氯仿快速抽提、 酶切鉴定转化子 实验步骤 挑选阳性克隆子培养 抽提质粒 酶切 电泳鉴定 质粒提取 1.5mL过夜培养菌液 倒入EP管中,12000g,1’,离心 弃上清, 涡旋振荡器振松菌块 加入100uLTE, 混匀 加入100uL酚/氯仿混匀 12000g, 5’,离心 吸取上清移入新的EP管中 12000g离心10’ 弃上清, 加200uL70%乙醇洗涤 12000g离心2’, 干燥 沉淀溶于10uLTE(RNase)中 酶切 取3-5uL在10-20uL体系中进行EcoRI酶切反应