第五章体外放射分析技术核医学.pptVIP

第五章 体外分析技术 概 论 1959 Berson Yalow RIA 体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。 第一节 体外标记免疫分析的基本原理放射免疫分析法 (RIA) 原 理 竞争性的抑制反应 Ag+Ab Ag Ab + * Ag * Ag Ab Ag+Ab 一、竞争性体外标记免疫分析的基本原理 1. 特异性抗体(Ab)的数量必 须是有限的 2. *Ag 和Ag具有相同的免疫活 性，与Ab具有相同的结合能力， 3. *Ag 和Ag与Ab的竞争性结合是可逆的动态过程 4.设法把结合型B和游离型F分离开，分别测定B 和F的放射性。 5.标准曲线的绘制 6.待测抗原浓度的确定 第 二节体外标记免疫分析的基本试剂和基本技术 （一）抗体 1.亲和力 2.特异性 3.滴度 （二）标记抗原 （三）非标记抗原（标准品） 分离方法 （一） 液相分离技术 （二） 固相分离技术 分离方法的要求 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 三、分离方法 （一）液相分离技术 1.双抗体沉淀法 2.聚乙二醇法(PEG) 3.葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法 4.活性炭吸附法 （二）固相分离技术 （五） 测量仪器 1. γ射线探测器（γ免疫计数器） 2.液体闪烁计数器(liquid scintillation counter) 实验操作步骤 1. 配制一系列已知浓度的标准抗原Ag的反应管，并标明浓度；2.分别向反应管中加入固定量的*Ag、Ab；3.经过一定时间的温育竞争结合反应； 4.待竞争结合反应平衡后，分离结合B（Bond）部分和游离F(Free)部分；5.用放射性探测器测得*Ag-Ab放射性为B或游离*Ag的放射性为F； 6.计算出结合率B%[B/（B+F）×100]，或B/B0%；B0为不含Ag的结合率，因Ag为“0”，故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率； 7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0随Ag量变化的曲线即为标准曲线（图4-2）。 8.在相同条件下，测得被测样品Ag的B%或样品/B0%的浓度与标准曲线对照，即可查出被测样品Ag的浓度。 四、 主要技术指标 （一）精密度 （二）灵敏度 （三）准确度 三、质量控制（quality control） 1、精密度（precision） 变异系数（ CV ）7%~10% 五、 质量控制 ㈠ 质量控制的目的 ㈡ 内部质控 随机误差 系统误差 1.最高结合率（B0%） 2.非特异结合率（NSB%） 3.标准曲线直线回归的参数 4.ED25，ED50，ED75 5.反应误差关系（RER） 6.质控图（quality control profile） 免疫放射分析法 (IRMA) 原 理 利用125I标记抗体作示踪剂与非标记抗原（待测样品或标准品）形成复合物，除去多余的游离抗体，测量复合物的放射性 灵敏度比放射免疫分析法有明显提高，且标准曲线的测量范围也明显扩大 特点： 1 属于非竞争性抗原、抗体结合反应 2 抗原-抗体复合物的量与所加非标记 抗原的量呈正相关 3 在低剂量区不会有不确定因素 4 免疫放射分析法的非特异结合对低剂 量区结合影响大，对分离条件的要求非常严格 基本方法 ㈠ 双抗体夹心法 ㈡ 标记第三抗体法 ㈢ 其他方法 ：生物素 - 亲和素系统 RIA与IRMA的比较 非放射性标记免疫分析技术 类 型 一、酶标记免疫分析技术 二、化学发光免疫分析技术 三、时间分辨荧光免疫分析 RIA与非放射性标记免疫