第五章分子生物学研究法克隆载体.pptVIP

??????????????????????????????????????????????????????????????????? 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 　　 这两类λ噬菌体载体具有不同的特点，在基因克隆中的用途也不尽相同。 插入型载体 只能容纳较小分子的外源DNA片段（一般在 10kb以内），广泛用于cDNA及小片段DNA 的克隆。 取代型载体 可容纳较大分子的外源DNA片段。 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 3) 柯斯质粒载体 (Cosimid) “ Cosmid” 一词是由英文“ cos site-carrying plasmid”缩写 而成的， 原意是指带有粘性末端位点的质粒。 是一类由人工构建的含有?DNA的cos序列和质粒复制子的 特殊类型的质粒载体。 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 图: pWEBTM 载体 示意图 Cos 序列 ampr 四部分组成: 一个复制起点； 标记基因； Cos 位点； 克隆位点。 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 柯斯质粒载体的特点: 其中的λ噬菌体片段带有一个将DNA包装到λ噬菌体颗粒中 所需的序列（cos粘性末端），在其两端还具有与噬菌体包 装有关的短序列，故又能被包装成具有感染性的噬菌体颗粒。 - 其中的质粒DNA部分是一个完整的复制子，包括复制起始位 点、一个或多个酶切位点和抗菌素抗药性基因（Ampr和/或 Tetr），因此柯斯质粒也能象质粒一样在细胞内复制和筛选； - 柯斯质粒兼具了质粒和噬菌体二者的优点。 - 具有高容量的克隆能力, 克隆极限可达45 kb。 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 　　 4）噬菌粒载体 （phagemid或phasmid） 一类由质粒载体和M13噬菌体载体结合而成的新型载 体系列，称为噬菌粒载体 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 　　 （1） pUCll8和 pUCll9 pUC118和pUCll9是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成的噬菌粒载体。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反而外，两者的分子结构完全一样（见图）。 　　如果有某一种特定的外源基因被插入在这一对噬菌体载体多克隆位点区的同一种限制位点上，那么所形成的重组载体中的一个将转录克隆基因的正链DNA，而另一重组载体则转录克隆基因的负链DNA。所以，应用pUC118和pUCll9噬菌粒作载体，克隆基因的两条链都将能够被有效地合成出来。 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 　　 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 　　 在寄主细胞没有感染上辅助噬菌体M13的情况下，噬菌粒载体的复制就如同双链质粒载体DNA一样，是受起源于ColE1质粒的LK复制起点控制的。按这种复制模式产生的双链载体DNA分子仍然保留在寄主细胞内。 当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染之后，载体便转向按照M13噬菌体的滚环模型进行复制。它是受存在于这两个pUC载体上的M13噬菌体复制起点控制的。所产生的单链载体DNA分子可以被包装进入由辅助噬菌体提供的外壳蛋白质中，形成的噬菌体颗粒随后被挤压出寄主细胞，分布在周围的培养基中。 pUCll8和pUCll9噬菌粒载体的复制模式 第五章 分子生物学研究法 二. 基因克隆的主要载体系统 　　 pUCll8和pUCll9噬菌粒载体的优点 : - 具有小的分子量, 可克隆高达10kb的外源DNA片段，并易于进