三种海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存的研究.pdf

华中农业大学博士论文 三种海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存研究 摘要 由于自然环境演变和人类生产活动的影响，自然水体中的鱼类有相当一部分已 经濒临灭绝，保护环境，保护物种已是人类面临的一大课题。鱼类配子和胚胎超低 温冷冻保存做为种质资源长期保存的技术途径之一，具有广阔的应用前景。 本课题首次将玻璃化冷冻思想引入海水鱼类胚胎冷冻保存研究，首次利用珍贵 海水养殖鱼类花鲈(Lateolabrax olivaceus)和大菱 japonicus)、牙鲆(Paralichthys maximus)不同发育阶段的胚胎做为实验材料，对海水鱼类胚胎玻 鲆(Scophthalmus 璃化冷冻保存技术进行了较系统的研究。 本文首先对1，2一丙二醇、甲醇、二甲亚砜、甘油、二甲基甲酰胺、乙二醇、 聚乙烯毗咯酮、聚蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等渗透性抗剂和非渗透性抗冻剂毒性进 行了研究，认为1，2一丙二醇和甲醇对鱼类胚胎的毒性较低，在玻璃化液中加入聚乙 烯吡咯酮有利用于玻璃化形成和防止反玻璃化现象发生。 通过对基础液盐成分的筛选和调节，溶液渗透压和pH值的测定，胚胎在基础 液中培养研究，筛选出了适合于胚胎玻璃化冷冻保存的基础液BS2。 在抗冻剂毒性分析的基础上，配制了80种不同成分和浓度的抗冻剂，通过冷 冻和解冻时玻璃化形成能力，选择出了适合于花鲈胚胎冷冻保存的玻璃化液VSD2。 在基础液BS2中对抗冻剂配比进行调整，经过胚胎平衡实验，筛选出了适合于牙鲆 对PM系列玻璃化液在5C／mia慢速降温过程中冰点、过冷点的产生和变化进 行研究，发现浓度在41％以上的玻璃化液降温时不产生冰点结晶．而40％以下玻璃 化液在慢速降温时在冰点出现了结晶。 对玻璃化冷冻和解冻过程中玻璃化液温度变化进行了研究，发现从13℃冷至一 对蔗糖、葡萄糖、半乳糖、海藻糖几种糖溶液的洗脱效果进行比较，对洗脱时 7 三种海求鱼类胚胎玻璃化冷冻保存研究 间、洗脱液浓度、洗脱方法进行筛选研究，结果显示利用0．125mol／L蔗糖对玻璃化 液处理后的胚胎进行一步洗脱成活率较高，洗脱时间在15min为宜。 对花鲈、牙鲆、大菱鲆三种鱼类不同对期胚胎分别在玻璃化液中的适应性进行 了研究，发现花鲈尾芽胚、心跳胚和出膜前期胚对VSD2的耐受能力较强；牙鲆4 —5以肌节胚、16—20对肌节胚、尾芽胚对PM3的耐受能力较强，大菱鲆4--5对 肌节胚、16—20对肌节胚、尾芽胚对PMPl的耐受能力较强，较适合于进行玻璃化 液处理和冷冻保存{并且确定了三种鱼类各时期的胚胎在玻璃化液中的适宜平衡时 间，为胚胎在玻璃化液中处理和冷冻提供了一定的参数。 通过一系列玻璃化冷冻技术的研究，对花鲈、牙鲆和大菱鲆的胚胎进行了冷冻 保存，首次在海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方面获得成活胚胎。并且孵化出形态正 常的鱼苗。 利用VSD2冷冻花鲈胚胎，分别在尾芽期、心跳期和出膜前期获得4粒成活胚 胎，其中l粒孵化出膜，成活率为2．17％一5．88％，成活时间为42—73h。 利用PMl--PM4和PMP分别对牙鲆胚胎进行玻璃化冷冻保存，冻存时间为t 一37h，在肌节期、尾芽期、心跳期和出膜前期都获得了成活胚胎，共获得2l粒冷 冻成活胚胎，其中有14粒孵化出膜，鱼苗形体正常，成活率为l‘64％--32．35％，在 无饲养的条件下成活时间为14—108h，并且在胚胎冷冻成活上有重复性。 利用PMPI冷冻大菱鲆4—5对肌节胚14h，解冻后有1粒胚胎成活，培育50h， 体长达3mm。 经过本课题的研究，首次建立了海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存技术体系，突破 了鱼类胚胎冷冻保存的技术难关，在鱼类胚胎冷冻成活和孵化数量上取得突破性进 展，觅补了国际上在该方面研究的空白：在鱼类低温生物学研究方面具有一定的理 论意义和应用价值。 关键词：花鲈，牙鲆。大菱鲆，胚胎，玻璃化冷冻保存 8 华中农业大学博士论文