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shRNA-1对应的mRNA二级结构预测结果 pSilencer? 4.1-CMV neo质粒图谱 如何设计RNAi 实验 A：半定量RT-PCR琼脂糖电泳结果； western 如何设计RNAi 实验 * 比如要检测的蛋白为A，它有a, b, c, d 四个表位(epitope)，可以被抗体特异性认识。制作针对A的抗体是将蛋白A的一段，比如包含b+c段，打入兔子（最常见）或其他动物（山羊goat，大鼠rat，鸡chicken，仓鼠hamster），由于这是外来入侵物，动物自身的免疫系统会生产针对它的抗体来清除这个异物，而产生的抗体有些会识别b位点，有些则识别c位点。之所不用完整的蛋白，是因为全长通常会太大。然后收集被免疫了的动物的血清，这个含有针对蛋白A的的多克隆抗体（因为是识别c+d的混合抗体）就称为抗血清（antiserum)。有的产品卖的直接就是抗血清，有的则再一步将抗体纯化出来。这种多克隆抗体一般会便宜一些。 而通过体外刺激小鼠的B淋巴细胞和肿瘤细胞的杂交瘤细胞，分别单克隆进行培养，可以产生出只针对一个表位b的单克隆抗体（monoclonal antibody），这种抗体的特异性更高，但价格也更贵。 抗体Y字形下面的主干部分称为恒定区(Fc)，所有人的抗体的Fc都是一样的 ，所有鼠的抗体Fc也都是一样，所有山头的Fc也都是一样 。 制作只含有兔子一抗 Fc段的片段，再打到山羊中，从而获得了针对兔Fc的抗体。 因为兔子不会对兔子的Fc产生免疫反应，不然就会产生自身免疫疾病，自己产生抗体攻击自己。所以可以是山羊抗兔的二抗。 制二抗，就是用一抗的Fc区去免疫动物，方法同制作一抗。 一抗是一对一（Fab对表位），二抗是一对多（动物二Fab的可变区对动物一Fc）。 可变区（Fab段上的可变区），正是这个区域特异性地识别抗原的表位。就像一把钥匙配一把锁一样，表位b只被含有b‘可变区的抗体识别。 二抗是抗一抗的恒定区。所以相对广谱。 而通过体外刺激小鼠的B淋巴细胞和肿瘤细胞的杂交瘤细胞，分别单克隆进行培养，可以产生出只针对一个表位b的单克隆抗体（monoclonal antibody），这种抗体的特异性更高，但价格也更贵。 底物化学发光ECL ,反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，可显影出条带。 辣根过氧化物酶在催化过氧化氢的情况下，鲁米诺底物被氧化而产生的发光反应 6. 免疫荧光技术 激光共聚焦扫描显微镜(confocal scanning fluorescence microscope ) 同样的成纤维细胞的三种细胞骨架成分 蓝色为细胞核，绿色为微管 7. miRNA靶基因的验证研究思路 研究思路 生物信息预测 Real time RT-PCR Western 双荧光报告系统验证 miRNA的表达上调 miRNA的表达下调 生物信息预测 PicTar (http://pictar.mdcberlin) TargetScan () miRBase Targets (). Example 1 Example 2 Topic 2: RNA interference and its mechanism 二、RNA干扰及其机制 RNAi的定义 双链RNA抑制与其同源序列基因的表达 2006年的诺贝尔生理学奖获得者： Andrew Z. Fire Craig C. Mello RNA干扰(RNA interference，RNAi) RNA干扰是dsRNA介导的特异性基因表达沉默现象，是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因表达调节机制。 1998年首次发现将dsRNA注入线虫可特异性抑制基因表达，并将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达现象称为RNAi。 是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。 其实质是通过双链RNA使目的mRNA降解，从而特异性地抑制目的蛋白表达。 Fig 2. Analysis of RNA-interference effects in individual cells. Fluorescence micrographs show progeny(子代）of injected animals from GFP-reporter strain PD4251 (a C. elegans strain expressing GFP fluorescence protein) (使用外源导入的报告基因). Young larva (幼虫) Adult (成虫) Control dsRNA ds-gfp RNA 2. siRNA的调控机制 双链RNA产生的小干扰RNA可以关闭基