去铁胺和铁调素对高铁环境下斑马鱼骨形成指标影响实验及研究.pdfVIP

去铁胺和铁调素对高铁环境下斑马鱼骨形成指标影响的实验研究 中文摘要 去铁胺和铁调素对高铁环境下斑马鱼骨形成指标影响的 实验研究 中文摘要 第一部分 去铁胺在铁过载相关骨形成抑制中的治疗作用 目的近年来，铁过载被认为是骨质疏松症的独立危险因素。铁过载可以促进破 骨细胞分化和骨的再吸收。本文研究了铁过载对斑马鱼成骨细胞分化和骨形成的影 响，并进一步探讨去铁胺（DFO ）对铁过载斑马鱼骨形成的治疗作用，为铁过载相关 骨质疏松症的治疗提供理论依据。 方法 以受精后第2 天（2 dpf ）斑马鱼幼鱼为模型，用不同浓度的枸橼酸铁胺FAC （10、25 、50、100μg/mL）干预斑马鱼，于6 dpf 进行茜素红染色并统计骨矿化面积； 在上述100μg/mL FAC 干预6 dpf 基础上，再移除FAC ，用不同浓度的DFO （1、10、 100μM）处理至10dpf。进行茜素红染色，对斑马鱼进行椎体个数统计，并用实时定 量PCR 方法检测了各组之间成骨细胞特异性基因（runx2a 、runx2b 、bglap 、spp1 、 alpl 和col1a1a ）的表达差异；用ICP/MS 分析了各组间的铁元素含量；用DCFH-DA 检测了各组间斑马鱼体内的活性氧（ROS ）水平。 结果 （1）、用不同浓度FAC 处理斑马鱼后，斑马鱼骨矿化面积成剂量依赖性降 低，与对照组相比，100 μg/mL 浓度组差异具有统计学意义（p 0.05 ）；成骨细胞特异 性基因表达下调；与对照组相比，100 μg/mL FAC 处理时斑马鱼体内铁含量增加3.2 倍 （p 0.05 ）；ROS 水平增加4.2 倍 （p 0.05 ）。（2 ）、DFO 可增加高铁干预后斑马鱼 的椎体个数，且呈剂量依赖性效应。成骨细胞特异性基因表达较高铁干预组有明显提 高。与高铁干预相比，用10 和 100μM DFO 处理使斑马鱼体内铁含量降低23.3%和 58.9% （p 0.05 ）；ROS 水平同样降低了37.5%和50.9% （p 0.05 ）。 结论 铁过载通过增加斑马鱼体内氧化应激水平抑制斑马鱼骨形成，去铁胺 （DFO ）通过螯合铁过载斑马鱼体内过多的铁离子，降低铁过载引起的氧化损伤，从 而缓解铁过载所致的骨形成抑制作用。 关键词 铁过载；斑马鱼；DFO I 中文摘要 去铁胺和铁调素对高铁环境下斑马鱼骨形成指标影响的实验研究 第二部分 铁调素在铁过载所致的斑马鱼骨形成抑制中的保护作用 目的通过前期研究，我们已经证实铁过载可以抑制斑马鱼骨形成，为观察铁调 素在铁过载抑制斑马鱼骨形成中的预防作用，我们构建了含有斑马鱼铁调素的表达载 体。以期为进一步研究“铁调素预防围绝经期和绝经后骨质疏松症” 提供实验依据。 方法 以斑马鱼受精卵为模型，用不同浓度的枸橼酸铁胺FAC （10、25 、50、 100μg/mL）干预，第4 天进行茜素红染色并统计骨矿化面积，选择FAC 最适干预浓 度；挑选发育至1-2 细胞期的斑马鱼受精卵，显微注射入不同浓度的带Flag 标签的铁 调素 mRNA （0、50、250 、500ng/μL ），用Western Blot 检测斑马鱼体内Hepcidin-Flag 融合蛋白的表达情况。将注射了不同浓度铁调素 mRNA 的受精卵置于含100μg/mL FAC 的培养液中，干预至第4 天进行茜素红染色，用实时定量PCR 方法检测骨钙素 （bglap ）及runx2a 、runx2b 基因的表达变化情况；用ICP/MS 分析了各组间的铁元 素含量；用DCFH-DA 检测了各组间斑马鱼体内的活性氧（ROS ）水平。 结果 （1）、成功构建了斑马鱼铁调素表达载体，在斑马鱼受精卵内显微注射体 外转录的hepcidin-flag mRNA ，能被有效翻译成铁调素蛋白。（2 ）、当铁调素浓度为 250ng/μL 及500ng/μL 时，能显著预防铁过载所导致的斑马鱼骨形成抑制