静磁场对大鼠成骨细胞与牙周炎组织影响及研究.pdf

中 文 摘 要 目 的 随着生物磁技术的迅猛发展，磁治疗在医学中的基础和临床应用研究 越来越受到关注，但是有关静磁场对牙周炎组织生物效应的研究未见报道。 成骨细胞是保持骨形态结构和性能的最小结构和功能单位，作为骨组 织的重要功能细胞，在骨的形成过程中起着关键作用。成骨细胞的增殖、骨 基质的分泌和钙盐沉积对骨的形成、重建和修复具有重要意义。 本实验通过建立体外培养大鼠颅骨成骨细胞实验模型，排除了体内复 杂的生物环境因素的影响，观察不同剂量的静磁场对体外培养的成骨细胞 生长的直接效应，专一的分析研究静磁场刺激对成骨细胞的生长和功能变 化的影响；建立牙周炎动物实验模型，研究静磁场对牙周膜组织结构、功能 的影响。从细胞水平和分子水平探讨静磁场对骨生长的作用机制，为临床 选择合适的磁场参数，科学的利用磁场疗法，提供实验依据。 方 法 1静磁场的设计 将钕铁硼永磁体充磁后固定于特制的长方形槽内，其上方可以放置各 种细胞培养板，调节槽装置的高度，使培养板底部的磁场强度分别为0Gs、 400Gs、620Gs、830Gs、1080Gs。 2大鼠颅骨成骨细胞的分离、培养 无菌操作下取出Wistar乳鼠头盖骨，刮去骨膜和软组织，经O．25％胰 酶和1mg／IIllⅡ型胶原酶消化后，应用差速黏附法分离成纤维细胞，置于 37℃、5％cO：饱和湿度的培养箱中培养，3天换液，待细胞长满平底后传代， 备用。 3成骨细胞的增殖活性测定 成骨细胞接种于96孔培养板内培养24h，将各培养板分别放入不同强 的0D值。实验重复2次。 4流式细胞仪测定成骨细胞周期 细胞接种于35衄直径的培养皿内培养72h，将各培养皿分别放入磁 加入PI染液，流式细胞仪检测细胞DNA周期。实验重复3次。 5成骨细胞AIJP染色及活性测定 传代成骨细胞接种于盖玻片上培养48h，并于620Gs磁场环境中继续 培养细胞48h。采用改良钙钴法进行AIP酶染色。 成骨细胞接种子96孔培养板内培养，并施加不同强度的磁场处理 仪上测定405nm的0D值。 6成骨细胞的I型胶原免疫组化染色及westem印记分析 传代成骨细胞接种子盖玻片上培养72h，并于620Gs磁场环境中继续 培养细胞48h。取出盖玻片，丙酮固定，采用sABc法进行I型胶原免疫组 化染色。 I型胶原。 7成骨细胞体外钙化检测 其中一侧加620Gs磁场，定期换液，培养2周。倒置显微镜下观察细胞的形 态和骨结节的数量。 8动物实验 8．1牙周炎动物模型制备 应用不锈钢丝结扎法制备wistar大鼠牙周炎动物模型。5周后去除结 扎丝，在大鼠头部颊部区切开皮肤，将充磁和未充磁的钕铁硼永磁体分别埋 入皮下组织中，于实验后第2、4、7天处死大鼠。切取病灶牙及其周围牙周 组织制备标本。 8．2行HE染色，光镜下观察牙周膜组织结构，电子显微镜下观察超微 结构变化 8．3BMP-2的免疫组织化学染色和原位杂交检测 组织切片采用SABC法进行BMP．2免疫组化染色，其中一抗工作浓度 ·2· 为l：l∞。 组织切片经胃蛋白酶处理，预杂交液42℃作用4小时后，滴加BMP．2 寡核苷酸探针，恒温箱42℃杂交过夜。 结 果 l相差显微镜下观察原代培养成骨细胞的形态 经差速黏附法分离的成骨细胞培养24h后，可见细胞呈梭形、三角形、 多角形等散在贴壁生长。7d左右基本长满培养瓶底。 2静磁场对成骨细胞的增殖作用 增殖作用不明显，P0．05。 3静磁场对成骨细胞周期的影响 经620Gs磁场处理，G0／G，期细胞所在比例降低，S期、G：／M期细胞百 M期细胞百分比与对照组相比无明显变化。 4静磁场对成骨细胞ALP酶的影响 成骨细胞浆处均可见有黑色颗粒状物质，有些融合成片，以磁治疗组明 进ALP酶的合成作用最强，与对照组相比具有明显差异，P0．05。 5静磁场对成骨细胞I型胶原的影响 成骨细胞的胞浆呈棕黄色