组织中RNA的制备与定量分析.pptVIP

随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 （二）引物的选择 （三）内参的设定 为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。 常用的内参有GAPDH （3-磷酸甘油醛脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。 OD值(optical density)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度. 在分析化学里,某一化学物质都可吸收一定波长的光,并且对光的吸收度与这样化学物质的浓度成正比.因此可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度. * * 核酸为两性分子,在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 总RNA的提取、定量与RT-PCR 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 目 的 实 验 流 程 提取原理 操作步骤 逆转录原理 操作步骤 提 取 总RNA 定 量 合成cDNA 第一链 原理体系 引物选择 PCR 电泳原理 电泳步骤 电 泳 计算方法 操作步骤 第一部分 组织总RNA的提取及定量 原 理 10-5mg RNA/细胞 mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 目前常用的是Trizol法。 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% Trizol的主要成分 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 原 理 所有RNA的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 关 键 点 RNA酶污染来源 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 防止RNA酶污染的措施 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 加 样 枪 的 使 用 实验材料 SD大鼠肝脏 实验试剂 Trizol试剂 氯仿 异丙醇 75%乙醇（现配现用） 无Rnase水 液氮