细胞工程-第五章细胞融合与单克隆抗体.ppt

第五章  细胞融合与单克隆抗体 二、人工诱导细胞融合 诱导细胞融合的主要方法有： 病毒诱导融合 化学融合剂诱导融合 物理方法（电融合） 二、人工诱导细胞融合 （一）病毒诱导的细胞融合 有许多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、副粘液病毒、鸡新城疫病毒等。其中最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ）,为RNA病毒。 基本概念 抗原 抗体 抗原决定簇（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体 抗原决定簇（Antigenic determinant） 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团 多克隆抗体（Polyclonal antibody,PcAb）： 针对多种抗原决定簇的混合抗体 单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb） 由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体 单克隆和多克隆抗体的比较和用途 单克隆抗体在医学中的应用 检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 HAT选择培养基 HAT选择培养基组分 次黄嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氢叶酸还原酶抑制剂） 胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T) 细胞DNA合成途径 1.主要途径： 氨 基 酸 谷 氨 酰 胺 尿核苷单磷酸 叶酸及其衍生物（必不可少的媒介） 2.补救途径：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HGPRT） 胸腺嘧啶核苷酸激酶（ TK） ELISA原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关 ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色 单抗纯化方法： 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 （1）盐 析 法 用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。 血清 50%饱和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白 （2）凝胶过滤法 干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。 交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 琼脂糖凝胶(Sepharose) （3）离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂 （4）亲和层析法 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原） 单克隆抗体特性 理化性状高度均一，生物活性