苹果果实腐烂病菌征求意见稿-6.26.docVIP

前 言 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，青岛农业大学，北京金纳信生物科技有限公司。 本标准主要起草人：邓丛良，李宝华，张凯，吕玉峰，梁新苗，汪万春，赵焕生，高文娜，。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了植物检疫中苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于进境水果中苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌的检疫鉴定。 2 有害生物信息 苹果和梨果实球壳孢腐烂病菌（Sphaeropsis pyriputrescens）属真菌界（Fungi），菌亚门（a），球壳孢目（Sphaeriales）。苹果梨。 3 仪器设备、试剂及用具 3.1 仪器、设备、用具 超净工作台、生物培养箱、电子天平、微量移液器、实时荧光PCR仪、高速冷冻离心机、高压灭菌锅、冰箱、解剖刀片、白磁盘保湿盒、研钵、吸头、eppendorf管、PCR管、生物显微镜，酒精灯、三角瓶（500mL）、镊子、载玻片、盖玻片。 3.2 试剂和培养基 检验所需的药品均为分析纯。 检验中用到的培养基有PDA培养基其配制方法见附录A。 3.3 标准菌株 Sphaeropsis pyriputrescens Xiao and J.D.Rogers 4方法原理 4.1 组织保湿法 将疑似携带球壳孢腐烂病菌的果实放于保湿箱中，28℃培养箱内在自然光或者弱光下培养，一周后观察有无分生孢子器形成。 4.2 分离培养法 取可疑的病果用70%的乙醇喷雾消毒，超净工作台上自然干燥。用解剖刀将病果发病部位的表皮部分去掉，在病健交界处切下小块果肉，在PDA培养基内（20～22℃）培养3-14天，观查菌落生长情况。 4.3 子实体诱发实验 为了方便识别病菌，PDA培养基在20℃下用黑暗和荧光交替培养12h来诱导孢子或者子实体的形成。 4.4 致病性测定 于取采收前2-4周，择取近期没有接触过杀菌剂的苹果或者梨果实进行致病性实验。果实用0.5% NaOCl的表面消毒5 min，无菌水漂洗3次，置无菌条件下干燥。将Sphaeropsis pyriputrescens在PDA培养基上交替培养（12 h光照/12 h黑暗）3周，诱导产生分生孢子，用分生孢子悬浮接种果实。孢子悬浮液用纯净水配制，浓度调节为每ml1 × 104个孢子，用直径为4mm的针头，扎入果实内4mm，造成的伤口，然后用吸液管滴入20 μL分生孢子悬浮液接种。将接种果实用果实网套包裹，放于纸箱中用纤维板开，放于0℃下保存，6-8周呈现腐烂症状。为了验证对梨果实的蒂部和萼端致病性，用灭菌解剖刀在果实的蒂部平切，造成伤口，用灭过菌的纱布（2 × 2 cm）蘸下菌悬液，包裹蒂部和萼端接种。以蘸有蒸馏水的纱布包裹的梨果实为对照。为了促进病菌侵染，将接种水果放在铝盘上，再将盘子置于有水的密闭容器中（20～22℃）过夜。然后去掉接种纱布，将果实放于纸箱上，按上述方法存放， 2-3个月后呈现腐烂症状。 4.5 实时荧光PCR检测 4．5.1 DNA提取 CTAB法：参照分子克隆实验指南（第三版）或参照公司真菌DNA提取试剂盒DNA，用设计的特异性引物进行实时荧光PCR检测。实时荧光PCR反应体系和条件见孢腐烂病菌在PDA平板，为浓密无色的菌丝， 20°C黑暗培养7-14天，菌丝变为黄色菌落黄色素沉识别该菌特征。20°C下，在A培养基上12h光/12h黑暗交替培养3周分孢子器。孢腐烂病菌菌分孢子褐色，一端膨大，末端扁平，μm。 5.4 致病性结果 接种果实应呈现典型的球壳孢腐烂病症状，经病原菌再分离获得的纯菌株应具有与原菌株保持一致的病原特征，对照不出现球壳孢腐烂病症状。 5.5 实时荧光PCR检测 进行实时荧光PCR检测Ct值。 6 结果判定 待测样品的Ct值小于或等于35时，如果症状或者病原菌培养性状与第5章节鉴定特征吻合的，则判定检出苹果果实腐烂病菌Ct值小于35时，如果症状或者病原菌培养性状和致病性测定与第5章鉴定特征吻合的，则判定检出苹果果实腐烂病菌孢腐烂病菌。 7 样品和菌株保存 7.1 样品保存 检出样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出苹果果实腐烂病菌的样品应保存于4°C冰箱，以备复核保存期满后经灭菌后方可处理。 苹果果实腐烂病菌20°C培养4～6天，然后4°C冰箱保存。或液体培养至对数生长期，然后加入20％灭菌甘油，-80°C长期保存。 7.3结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。PCR检测需有电泳结果图片，Xiao CL, RogersJD. 2004.Apostharvestfruitrotind’Anjou pears caused by Sphaeropsis