高效液相色谱法测定饮料中咖啡因.docVIP

高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因摘要：目的研究了高效液相色谱法直接测定饮料中咖啡因的新方法。方法采用Hypersil ODS 柱，以甲醇+乙酸铵（0.02mol/L）=15+85 作流动相，流速1.0mL/min，检测波长207nm，柱温30。结果6min 内将咖啡因与基体分离，咖啡因含量与峰面积在10～200μg/mL 范围呈线性关系，相关系数r=0.9998；回收率范围为97.4％～101.4%。结论该法准确，样品处理简单。，其化学结构式如下图： 饮料中咖啡因含量的测定方法一般有紫外分光光度法和高效液相色谱法两种。在化学键合相色谱法中，若采用的流动相极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。由于在一定的实验条件下，同一组分的保留值保持恒定，因此在同种条件下，将发酵产物中各组分的保留时间与标准品对照，即可确定该组分存在与否。本实验采用峰面积进行含量计算。通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。 1 仪器与方法1.1 检测仪器及试剂Agilent 1100LC 高效液相色谱仪（紫外检测器）；甲醇（HPLC），乙酸铵（AR），咖啡因精制品（中国药品生物制品检定所）。1.2 色谱条件色谱柱：Agilent Hypersil ODS 4 ×125mm（5μm）；流动相：甲醇+乙酸铵（0.02mol/L）=15+85；流速：1.0mL/min；检测波长：207nm，柱温30；进样量：10μL。1.3 样品处理汽水、可乐型饮料用超声波清洗器在40下超声5min 脱气。取脱气液10mL 通过0.45μm 水系滤膜过滤，弃去最初的5mL。果汁类饮料离心，取上清通过0.45μm 水系滤膜过滤，弃去最初的5mL。1.4 标准溶液的制备准确称取0.1000g 咖啡因，溶于水，转移到100mL 容量瓶，加水定容。此溶液浓度为1.0mg/mL。2结果与讨论 2.1 咖啡因标准溶液国标GB/T 5009.139-2003 中，紫外分光光谱法的咖啡因标准储备液和标准使用液均用重蒸的三氯甲烷配制，高效液相色谱法的咖啡因标准储备液和标准使用液均用甲醇配制。有机溶剂容易挥发，导致浓度不准确；1g 咖啡因能溶于46mL 水，故本法直接用蒸馏水溶解咖啡因粉末。实验表明，咖啡因水溶液的峰形也十分尖锐（见图1）。但不同的溶剂体系，咖啡因的最大吸收波长会有差异。2.2 色谱条件嘌呤类生物碱基均具有共轭离域大π 键结构，在紫外光区有强烈吸收。由紫外光谱扫描可知，咖啡因的水溶液在接近207nm、273nm 处有两个依次降低的吸收峰，本法采用最大吸收波长207nm 作为检测波长。流动相是色谱分离中重要的一步，直接关系到分析的灵敏度和能否将样品中的组分有效洗脱分离。国标检验法的流动相为甲醇＋乙腈＋水＝57＋29＋14 （每升流动相中加入0.8mol/L 乙酸液50mL），该法在实际操作中易造成峰形重叠，干扰检测结果[3]。乙腈剧毒，而且食品添加剂的常检项目－苯甲酸、山梨酸、糖精钠和合成着色剂，所用的流动相均是甲醇和乙酸铵，为了保护 操作人员和减少配制多种流动相的麻烦，故咖啡因的检测，也选择甲醇和0.02mol/L 乙酸铵溶液作为流动相。改变甲醇比例（15%～30%），结果表明甲醇比例为15%，流速为1.0mL/min 时，咖啡因在5.7min 出峰，保留时间比较适宜，而且饮料中常见的添加剂，如苯甲酸、山梨酸、糖精钠均不干扰咖啡因的测定（见图2），适合批量检测。2.3 线性关系将配制好的一系列标准溶液（10，25，50，100，200μg/mL）按上述色谱条件进样10μL，以峰面积（y）对相应浓度（c，μg/mL）作回归分析，得到回归方程为：y=93.67c+127.08，相关系数r=0.9998，咖啡因浓度范围在10～200μg/mL 线性较好。 2.4 精密度和回收率准确吸取标准溶液10μL（50μg/mL），重复进样6 次，测得RSD=0.31%（n=6）。取含咖啡因的样品，按低、中、高三个水平分别准确咖啡因标准溶液，按样品处理测定其回收率，结果见表回收率在97.4％～101.4%之间。  由上可知，精密度和回收率均符合实验要求，本法样品处理简单，标准溶液配制浓度准确，避免使用剧毒试剂，保护了实验人员，且方便多个项目的检测。 ?