FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64的构建.docVIP

FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的Wang zhiqiang Department of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060 实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64）。实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建2.293细胞和Hela细胞的培养3.磷酸钙转染4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒5．设计公共PCR引物6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒7. 浓缩纯化重组腺病毒8. 测定病毒滴度（50％组织培养感染量TCID50）9.体外安全性研究纤维连接蛋白羧基端细胞结合域FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。基因转染技术加强改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题。这一，不仅获具旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白利于组织构建。腺病毒载体是组织工程基因改造的常用病毒性载体，其他载体，腺病毒载体是最潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞非分裂细胞能力，制备、纯化和储存，滴度高容量大[1]。能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不整合宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。腺病毒能够高效地在体外途径进行基因转移，操作[2]；病毒转染24小时后且持续14天以上，这与使用种子细胞体外构建所需要时间相一致，病毒载体可在体外对种子细胞进行基因改造，以满足我们的需要，用于构建。限制性核酸内切酶BioLabs公司DNA分子量标准品PCR试剂TaKaRa公司DNA包装蛋白Novagen公司高糖DMEM培养液PRMI1640培养液胎牛血清（FCS）GIBCO公司PCR引物上海生工生物工程有限公司新生小牛血清（NCS）杭州四季清公司BES（N-2-羟乙基-2-氨基乙磺酸）CNI公司胰酶、二甲基亚砜（DMSO）Sigma公司Sephadex G-50介质Amersham Pharmacia公司氯化钙（CaCl2）、氯化铯（CsCl2）Amresco公司硫酸链酶素上海四药股份有限公司青霉素钠上海先锋药业有限公司主要仪器电泳仪PhastSystemPharmacia Biotech公司恒温烤箱Fisher公司CO2培养箱BB5060Hereaus公司PCR仪 GeneAmp PCR System 2400PERKIN ELMER公司RC-26低温高速离心机杜邦公司MDF3820 -70℃低温冰箱SANYO公司TGL-16C台式离心机上海安亭科学仪器厂12孔排枪、枪头、Eppendorf管BIOHIT公司Olympus IX-70倒置相差显微镜日本奥林斯公司细胞人胚肾293细胞ATCC CRL1573），Hela细胞中国科学院上海细胞所1. 构建FnCBD64重组腺病毒粘粒载体(1) FnCBD64 DNA片段回收加工(2)粘粒载体pAxCAwt酶切纯化(3)目的粘粒载体重组pAxCAwt. FnCBD64的获得(4) 鉴定和扩增pAxCAwt. FnCBD642. 293细胞Hela细胞培养(1)常规培养：含10％血清培养基中（293细胞用DMEM培养液，HeLa细胞用1640培养液），37℃5％CO2条件下培养。传代：对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化制成细胞悬液，按一定浓度加入新瓶中培养。(2)冻存：取对数生长期细胞，0.25%的胰消化酶制成细胞悬液，离心，弃上清，加入1ml冻存液，打匀制成细胞悬液，细胞浓度为106107/ml。转移至细胞冻存管，按顺序4℃1小时，-20℃2小时，-80℃4小时，而后置液氮中长期保存。(3)复苏：从液氮中取出细胞冻存管，迅速置于37℃温水中融化，液体移入10ml离心管，加无血清培养基5ml，1000rpm离心5min，弃上清，加入新鲜含血清培养基，移至细胞培养瓶中培养。 3. 磷酸钙转染法(1)细胞准备：用6cm、10cm培养皿培养293细胞，覆盖率至70-80％左右。转染前12h更换培养液。(2)磷酸钙-DNA沉淀的制备：取两个1.5ml无菌Eppendorf管，A管中首先加入MQ-H2O 170μl、1M CaCl2 80μl，轻微吹打混匀，然后加入DNA-TPC 5μl、重组粘粒（pAxCAwt. FnCBD64）200μl（8μg）和CaCl2 45μl，总体积500μl，上下混匀两次；B管加入2×BES 500μl