质谱分析法鉴定多形汉逊酵母Pex14p的磷酸化位点.pptVIP

质谱分析法鉴定多形汉逊酵母Pex14p的磷酸化位点 Identi?cation of phosphorylation sites in Hansenula polymorpha Pex14p by mass spectrometry Pex14p是过氧化物酶体膜蛋白，它既参与过氧化物酶体的增殖，也参与过氧化物酶体的选择性降解。 作者之前发现，活体多形汉逊酵母中的Pex14p 是以磷酸化状态存在的。 但是，具体的磷酸化位点和生理作用尚未知道。 本文通过质谱分析确定了Pex14p的具体磷酸化位点，并试图分析其在过氧化氢酶体增殖和吞噬中的作用。 H6-Pex14p的cDNA和pHIPX4 载体连接，得到pHIPX4-H6PEX14，转化Δpex14细胞。 用含甲醇的培养基诱导酵母表达，培养基中仅含有32P的磷酸盐。酵母中过氧化物酶体大量增殖。 随着时间增长， Pex14p中的磷酸化位点都会变成32P标记的。 质谱分析 A 从过表达酵母菌株中提取H6-Pex14p ，然后进行SDS，考马斯亮蓝染色 B 划线部分是观测的多肽序列，带*的是磷酸化位点 C 通过分析质谱图得知，磷酸化位点在Thr248和Ser258 为了进一步研究磷酸化的生理作用，作者选育三种不同的突变株，分别是T248A 、S258A 和T248A/S258A 突变体。 分别用Ala取代T248和S258 之后转移到葡萄