大肠杆菌菌浓的测定及发酵罐实验的了解.pptVIP

实 验 六 大肠杆菌菌浓的测定 及发酵罐实验的了解 目的要求 学习比浊法测量细菌数量的方法； 学习空气浴摇床的使用方法； 学习分光光度计和离心机的使用方法； 掌握菌浓和菌体干重关系曲线的测定方法； 了解通用发酵罐的基本结构。 了解发酵罐实验的一般流程及注意事项。 微生物生长曲线的测定 比浊法 干重法 菌落计数法 血球计数板计数法 … 菌浓OD600与菌干重的对应关系 将大肠杆菌用LB培养基进行培养，在快速生长中期取样，分别用去离子水（新鲜LB培养基）稀释至不同浓度，分别测定OD600值。同时取10mL菌液，8000rpm离心5min后，弃菌液，并用无菌水重悬洗涤、离心2次， 80℃下烘干至恒重后，测得干重。 菌浓与OD600的对应关系如下图所示。 经数据拟合，线性良好。 大肠杆菌菌浓OD600与菌干重的关系曲线 编号 样品浓度（g/L） OD600 离心管空重（g） 离心管+菌 重量（g） 实验材料 菌种： 大肠杆菌。（老师提前准备菌种和用于菌体干重测定的菌液） 仪器和其它物品： 722型分光光度计，空气浴振荡摇床，离心机，比色皿，试管，移液器、枪头、离心管等。 上次灭菌的肉膏蛋白胨液体培养基。 发酵罐 发酵培养基 发酵菌种 火圈… 实验内容分配 每4人一组 每组建立一个菌浓和OD600关系曲线。 分光光度计的实验 空白对照 吸光度和透光度 吸光度值的适用范围 离心机的使用 离心管平衡! 离心效果与转速、时间的关系 【实验内容】 1. 离心管称重 将一干净15ml 离心管，用分析天平准确称重并记录。 2. 菌液离心 将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，准确吸取菌液10ml加至已称重的离心管内(取液前将培养液振荡，使细胞均匀分布) 。与另一加水的相同离心管进行配平。8000rpm离心5min，弃去上清，加去10ml离子水重悬菌体，离心。再重复上述洗涤操作1次。弃去水溶液，将带有菌体的离心管在80℃烘干至恒重。准确称重并记录。 【实验内容】 3. 菌液稀释 将老师准备好的大肠杆菌摇瓶，吸取一定体积的菌液至试管中，在不同试管中按不同比例进行稀释。（至少5个水平） 4. 测定吸光度 用未接种的肉膏蛋白胨液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。最好使其光密度值在0.1~0.7之内(测定OD值前，将待测定的样品液振荡，使细胞均匀分布)。 做一个以去离子水稀释的对比试验（以去离子水做空白对照），看肉膏蛋白胨培养基对OD600吸光度的影响。 通用发酵罐的基本结构 在你所见到的实验室发酵罐上是否找到对应功能的部件？ 发酵罐实物图 控制主机 罐体 通气系统 空压机、通气管、流量计… 搅拌系统 电机、搅拌桨、挡板… 控温系统 升温、降温 传感器 pH、温度、溶氧、泡沫… 补料系统 消泡系统 取样口、接种口 发酵实验的一般操作过程 准备菌种（大肠杆菌） 准备培养基 校准电极（pH、溶氧…） 发酵罐（含培养基）灭菌 接种 发酵及取样分析（~24h） 下罐 发酵取样记录表格 标号 发酵时间(h) 取样体积(ml) 稀释倍数 OD600 菌浓 (g/l) 实验报告内容 OD600与菌体干重的关系曲线 画出实验室发酵罐的示意图（包括主机、罐体、通气系统、搅拌系统、控温系统、传感器等） 思考题 除了比浊法，还有其他什么常用方法可以测量细菌数量，各有什么优缺点？ 通用发酵罐主要用于好氧微生物的大量培养，发酵罐中那些部件与促进氧气的供给有关？ 实验六 结束 请交报告！ * 仪器不同,所测吸光度的上限会有差别. 吸光度的定义: 吸光度（absorbance）：是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的以10为底的对数（即lg(Iin/Iout)）/view/414285.htm * 吸光度和透光度的定义 吸光度值的线性范围？ 需要有空白对照 * 离心管的装样量不宜过多，以免离心过程中溢出。 离心转速与时间的关系：为达到良好的离心效果，可以在转速不能太高的情况下适当延长离心时间。 * * 可以做一个以去离子水稀释的对比试验，看LB培养基对OD600吸光度的影响。 * * 通用发酵罐一般用于好氧微生物的大规模培养，实验室中配制的也大多属于通用发酵罐。 通用发酵罐一般包括罐体和主机两部分。实验室发酵罐罐体多为玻璃制成，工业发酵罐罐体多为不锈钢制成。 发酵罐包括机械搅拌（电机、主轴、搅拌桨、消泡桨）、通气（空气压缩机、空气过滤器、空气分布器）、控温（夹套或冷却水管）、挡板、传感器（pH、温度、溶氧、泡沫等）等。 1、准备菌种（大肠杆菌） 提前进行摇瓶培养种子，待接种时菌种处于对数生长期为宜。 2、准备培养基 根据发酵液的起泡情况