DNA的测序.ppt

5.4 DNA测序技术 DNA测序的方法 传统的DNA序列分析法： Sanger双脱氧链终止法 Maxam-Gilbert化学分析法 新发展的DNA测序法： 杂交测序法 5.4.1 Sanger双脱氧链终止法 （一）原理： 在正常的体外DNA合成体系中，添加双脱氧核苷三磷酸，它们与相应的脱氧核苷三磷酸竞争结合于新合成的DNA链上，从而引起DNA链的终止。 在一次测序反应中设置一套四组反应，每一组反应体系中分别加入一种双脱氧核苷三磷酸。从而形成四组反应产物，分别相对于A、T、G、C的位置，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和放射自显影从而获得DNA序列。 双脱氧链终止法要求使用一种单链的DNA模板和一种适当的DNA合成引物。 利用DNA聚合酶的两种酶催化反应的特性 第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为 模板，合成出准确的DNA互补链； 第二，DNA聚合酶能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的延长。 （四）双脱氧链终止法的基本过程 制备DNA样品; 单链DNA分离; 测序酶引导下合成一套链终止产物； 测序胶高压电泳分离； 序列的读取. Sanger双脱氧-M13体系 M13是噬菌体载体，可以得到单链的DNA序列。 （五）双脱氧链终止法的基本试剂 模板：需采用各种方法分离单链模板，高质量; 引物： 特异引物需专门设计 DNA聚合酶：Klenow片段：价廉，持续合成能力低，较难通过二级结构区，测序长250碱基. 测序酶;TaqDNA聚合酶; 放射性标记：不安全，条带模糊. 模板 两类DNA可以用作Sanger法测序的模板： 纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA. 从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA模板效果最佳。 变性双链DNA作模板，则较难获得高质量的结果。 引物 酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。 更简便的方法是采用与位于靶DNA侧翼的载体序列互补的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。 如：适于M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15~29个核苷酸，并可与紧靠M13mp18噬菌体多克隆位点区的HindⅢ位点或M13mp19噬菌体多克隆位点区的EcoRⅠ位点的序列互补。 DNA聚合酶 常用于双脱氧法序列测定的酶有许多种，其中包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、反转录酶、经过修饰消除了3’-5’外切酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶和测序酶，以及从嗜热水生菌分离的耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段 Sanger在最初建立双脱氧链终止法时所用的酶。 两个缺点: 1 持续合成能力低。利用该酶进行标准测序反应所得序列长度有限。通常只能得到大约250~350个核苷酸序列。 2 这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。 （2）测序酶 一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。该酶经修饰后缺失3’-5’外切酶活性，及其稳定而且比未经修饰的测序酶活性高2倍。持续合成能力强，聚合速率高，是测定长段DNA序列的首选酶。 （3）TaqDNA聚合酶 该酶适用于测定在37℃形成大段稳定二级结构的单链DNA模板序列。这是因为该酶在70~75 ℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。利用该酶测序，在放射自显影片上得到的测序图谱连续数百个碱基条带始终清晰如一，表明该酶持续合成能力强。 5.4.2 Maxam-Gilbert化学修饰法 原理： 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。 化学切割反应的试剂： 肼（hydrazine） 硫酸二甲酯（dimethylsulphate） 肼： 又叫联氨（NH2.NH2），在碱性条件下，与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（ C ）作用。再通过六氢吡啶的作用，使两个磷酸分子从糖片断上释放出来，从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。 盐存在的条件下，联氨同胸腺嘧啶（T）的反应便会被抑制，最终只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应。 由此来区别C和C+T这两种化学反应 硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4） 一种碱性的化学试剂。 在它的作用下，DNA碱基环中的氮原子会发生甲基化反应，在中性的PH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微