限制性内切酶BamHI及具有外切酶活性的phi29DNA聚合酶有滚环扩增中的应用.pdfVIP

目 录 一、摘要 中文论著摘要……………………………………………．．1 英文论著摘要……………………………………………．．4 二、英文缩略语表……………………………………………．．8 三、论文 论文一………………………………………………………9 前‘言……………………………………………………．9 刖舌……………………………………………………·了 1 材料与方法………………………………………………1 实验结果………………………………………………．．15 讨论……………………………………………………25 结论……………………………………………………29 论文二……………………………………………………．．30 前‘言……………………………………………………30 日U舌……………………………………………………t)u 材料与方法………………………………………………31 实验结果………………………………………………．．35 讨论……………………………………………………42 结论……………………………………………………48 四、本研究创新性的自我评价……………………………………49 五、参考文献………………………………………………．．50 六、附录 综述……………………………………………………57 参考文献………………………………………………．．69 在学期间科研成绩…………………………………………76 致谢……………………………………………．……．．77 个人简介………………………………………………．．78 万方数据 ·中文论著摘要· 限制性内切酶Baml-ll及具有外切酶活性的 DNA聚合酶在滚环扩增中的应用 phi29 刖 吾 核酸作为重要的生物大分子之一，以一种遗传信息的形式在生物体内发挥各 种功能，是从亲代向子代传递信息的物质基础。核酸的合成、切割、连接、变构、 修饰等众多反应在细胞生命进程中无时不在，这对于维持正常基因组的复制及修 复、实施基因表达的调控具有重要的意义。许多酶也参与了各种细胞生命进程， 这些酶具有独特的酶活性，比如聚合酶、内切酶、连接酶、外切酶等，它们在基 础研究和应用研究中的应用非常广泛。 传统的酶活性检测方法为琼脂糖凝胶电泳、亲和力分析、高效液相色谱以及 酶联免疫吸附测定。这些方法具有连续性差、灵敏度低、检测过程长以及人工参 与多等缺点。在本研究中，我们使用以荧光共振能量转移为原理的方法对限制性 核酸内切酶进行测定。限制性内切酶切割DNA在生命活动中是十分常见的生物学 事件。然而核苷酸衍生物对限制性内切酶的影响尚不清楚。我们利用荧光共振能 量转移的方法对2’．甲氧基核苷酸和2’．氟代核苷酸对限制性内切酶BamHI和B胡I 的酶切效率的影响进行研究。 生命科学的高速发展需要先进的核酸分析和检测技术以完成高灵敏度和高特 异性的检测，而传统的检测方法往往难以实现。滚环扩增是新兴的一种体外核酸 扩增技术。它只需在常温下进行，操作简单易行。此外，以G．四链体为基本框架 的化学发光可视化检测也日益受到了人们的关注。 DNA聚合酶进行了研究。Phi29 在本文，我们首先对滚环扩增中所用的phi29 DNA聚合酶链具有5’．3’聚合酶特性以及3’．5’外切酶校读功能。我们利用phi29 DNA聚合酶的3’-夕f、切酶活性对靶核酸片段上3’末端的非互补序列进行剪切，考 察不同长度的非互补序列对滚环扩增效率