华南地区猪群中葡萄球菌分离鉴定及猪葡萄球菌EXHC毒素基因原核表达.pdf

摘 要 猪渗出性皮炎是由葡萄球菌引起的一种以哺乳仔猪和刚断奶仔猪的急性或超急 性接触性传染病，患病仔猪主要以渗出性，发热、脱水和死亡为主要临床特征，具有 传播快、死亡率高等特点。该病严重影响仔猪的生长发育，给我国养殖业造成了较大 的经济损失。 本研究针对华南周边地区疑似患有渗出性皮炎的病猪进行了葡萄球菌的分离鉴 定及分类；通过对筛选出的 7 株猪葡萄球菌脱落毒素基因的检测建立了脱落毒素基因 的PCR 检测方法；对鉴定出的 EXHC 基因进行了克隆和表达。 1、通过镜检、生化鉴定初步分离到了 16 株葡萄球菌；动物致病性试验中，猪葡 萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、松鼠源葡萄球菌、产色葡萄球菌的试验组小 鼠的死亡率分别为：100%，83.3%，66.7%，100%，16.7%，而模仿葡萄球菌、科氏葡 萄球菌的实验组有没有死亡个体；药敏试验中这些菌株对头孢类、新生霉素等抗生素 高度敏感，对青霉素类抗生素产生耐药性。 2、参照葡萄球菌Gap ( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases,甘油醛 -三磷酸脱氢酶) 和 16S rRNA 基因的通用引物对初步鉴定出的 16 株葡萄球菌进行了 基因克隆和序列分析。Gap 基因克隆测序结果在 NCBI 上进行 Blast 分析，分离的 16 株菌株可以归类为 Staphylococcus hyicus 、Staphylococcus epidermidis 、 Staphylococcus chromogenes、Staphylococcus simulans、Staphylococcus sciuri、 Staphylococcus cohnii、Staphylococcus haemolyticus，其同源性分别为 100%、 99%、93%、100%、98%、96%、99%，以上分离到的 7 类菌种与不同亚种之间的同源性 75.6～99%。16S rRNA 基因克隆、序列比对分析显示葡萄球菌属的不同亚种之间核苷 酸差异性不明显，同源性为 92%以上。 3、利用建立的PCR 检测方法对分离的 7 株猪葡萄球菌进行脱落毒素基因的检测。 结果显示 SHETA 的检出率为 100%；EXHA 的检出率为 28.7%；EXHC、EXHB 的检出率均 为 14.3%。 4、对分离的 GDZC 株进行了 Gap 基因的克隆及序列分析，并对 EXHC 基因进行了 克隆和表达。结果表明，该菌株 Gap 基因与 Genbank 已发表猪葡萄球菌（AF495492） 菌株的核苷酸同源性为 99%；EXHC 基因与 Genbank 上已发表的丹麦分离株 (AF515455) 核苷酸序列同源性为 100%。将 EXHC 基因插入 pET-28a (+)载体，经酶切和测序鉴定 正确后，成功构建了 pET-28a (+)-EXHC 原核表达载体。 关键词：葡萄球菌；猪葡萄球菌；渗出性皮炎；脱落毒素 Isolation and Identification of Staphylococcus from Pigs in South of China and Prokaryotic Expression of EXHC Toxins Gene of Staphylococcus hyicus Abstract Exudative dermatitis is caused by staphylococcus with a lactation piglet and just weaned piglets acute or super acute contact sexually transmitted diseases, sick with exudative, main piglets necrotizing dermatitis, fever, dehydration and death for characteristics, which is spreading fast, mortality, higher characteristic, 5-6 day-old