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丝素蛋白仿生支架调控嗅鞘细胞生物学行为 中文摘要 丝素蛋白仿生支架调控嗅鞘细胞生物学行为 中文摘要 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）不可避免造成神经元死亡及其轴突断裂，进 而导致神经支配功能的丧失。支持和引导轴突生长是 SCI 修复的关键。作为支持和引 导损伤神经元轴突生长的移植细胞，嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs ）具 有天然的优势。然而，SCI 后胶质细胞表达的抑制分子形成抑制轴突再生的化学屏障， 胶质细胞活化迁移在损伤部位形成的胶质瘢痕和空洞缺损成为轴突再生的物理屏障。 在此环境中，移植细胞难以定向迁移和有序分布，无法为再生轴突提供有效的支持和 引导，这是细胞移植修复 SCI 难以取得突破的重要原因。因此，通过组织工程构建仿 生支架定向分布移植细胞，克服损伤部位抑制分子和瘢痕空洞对轴突再生的不利影 响，为神经元轴突再生提供支持和引导，成为实现 SCI 功能修复的重要突破口，也是 目前SCI 修复的研究热点。 选择性能优异的生物材料是研究的前提。丝素蛋白（silk fibroin, SF ）以其优异的 生物相容性、良好的力学性能、可控的降解和可塑性能逐渐被研究者认知。支架仿生 构建关键在于对基质材料纳米结构的调控。近年来，SF 的自组装机制和纳米结构调 控研究取得重大进展。基于 SF 自组装机制的研究，本项目组获得结构均一的纳米线 结构单元，发现该纳米线结构对 SF 静电纺丝过程的纤维直径及走向具有重要影响， 可以使得 SF 纳米纤维的直径更为可控、取向更为有序。因此，作为组织工程支架的 基质材料，SF 具有天然的优势。 为探讨 SF 纳米纤维材料作为定向分布 OECs 的移植载体的可行性，本课题就以 下几方面内容进行探讨：（1）建立OEC 培养体系，倒置相差显微镜下观察培养周期 内细胞形态的变化，活细胞工作站观察OECs 连续动态的形态变化，明确同一培养条 件下 OECs 迁移运动的形态特征及其变化规律。（2 ）研究不同培养条件（有或无血 清，不同增殖剂：Forskolin 或 bFGF ）对OECs 的形态及其迁移能力的影响，明确不 同培养条件下OECs 迁移运动的形态特征及其变化规律，分析 OECs 迁移的调控机制。 I 中文摘要 丝素蛋白仿生支架调控嗅鞘细胞生物学行为 （3 ）静电纺丝工艺制备桑蚕丝（BSF ）和柞蚕丝（TSF ）纳米纤维支架，检测比较并 评价两种支架材料对 OECs 的形态、增殖、存活及其表型的影响，明确 SF 纳米纤维 支架的生物相容性及其优越性的具体体现。 （4 ）扫描电镜观察 SF 支架及细胞的超微 结构，光镜下观察细胞的形态及其分布，免疫荧光染色显示细胞表型及细胞骨架的发 育，活细胞工作站连续动态观察细胞形态特征，明确其变化规律，分析细胞迁移轨迹、 迁移速度、迁移速率等，研究静电纺 SF 纳米纤维支架的不同种类（TSF 与 BSF ）、 不同直径（400nm 和 1200nm）和不同取向分布（平行有序排列和无序网络状）及空 间拓扑结构对 OECs 迁移运动的影响，明确 SF 纳米纤维支架定向分布 OECs 的调控 作用及其机制。（5 ）RT-PCR 检测 OECs 的MBP 、NGF 、GDNF、BDNF 、NCAM 、 VEGF 的基因表达，ELISA 检测培养液上清中的蛋白含量，明确 SF 纳米纤维定向分 布的 OECs 表达功能基因和蛋白量的变化，分析其神经营养功能。（6 ）探讨 SF 纳米 纤维定向分布 OECs 对神经元生长发育的影响，明确定向分布 OECs 的生物学功能， 为进一步优化设计及其应用提供理论基础和实验依据。通过上述研究，本课题得出如 下结论，并分析其原因、意义及启示： （1）通过活细胞工作站连续动态观察发现，在同一培养条件下，OECs迁移过程 中表现出多样性变化的形态特征。分析细胞形态变化与迁移运动之间的关系，明确 OECs多样性的形态表现是由其功能状态决定的，不同形态的OECs适应不同的功能状 态：细长突起及梭形胞体形态有利于细胞迁移运动，扁平状有利于胞