第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选.docVIP

第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选 用 B-Domain 蛋白作为亲和材料纯化抗体时，由于其与 IgG 结合能力较强，在用于抗体纯化的洗脱过程中，洗脱条件苛刻，需要 pH2.4 的洗脱缓冲液，这种极端条件会很大程度地破坏抗体的活性，从而影响所纯化抗体的使用价值。而 B-Domain 用于抗体的定向固定时，则是其抗体结合力越强，越有利于定抗体的定向固定。噬菌体展示技术作为一种分子体外进化技术，经常应用于蛋白质或多肽的改造。鉴于此，本文构建了 GB2 的随机突变文库，首先是采用易错 PCR 将 GB2 进行随机突变，将突变 PCR 产物克隆至噬菌粒 pHEN I 中，然后用电转化的方式，将连接产物转化至 E.coli TG1 中，构建了 mtGB2 的随机突变文库，用 M13K07 辅助噬菌体感染 TG1 文库，得到 mtGB2 的噬菌体展示文库。以 IgG 为淘选靶分子，对文库进行两个方向的淘选，一个是淘选在 pH4.0 的洗脱缓冲液中能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体纯化领域；一个是在 pH2.4 仍不能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体的定向固定。 4.1 材料、仪器与试剂 4.1.1材料 E.coli TG1 购自Invitorgen、噬菌粒 pHEN I、Help phage M13K07 由英国剑桥医学研究委员会 (MRC) 分子生物学实验室 Gre