中国林蛙抗菌肽的改造.于淼.pptVIP

中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选 前言 抗菌肽自1972年发现以来， 一直受到人们的广泛重视。它在自然界中极其广泛地存在，从微生物、昆虫、动物、植物中，人们已经发现了超过1500种抗菌肽。抗菌肽的作用也是非常的广泛，不仅可以抑制、杀灭细菌， 而且具有抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、免疫调节等作用。另外，由于抗菌肽特殊的作用机制，其杀灭细菌时，不易诱导细菌产生抗药性。这些使得抗菌肽极有可能在未来成为一种代替抗生素的理想新药。然而，大多数天然存在的抗菌肽抗微生物的活性较差，很难达到药用的要求。要提高其生物学活性，对其分子结构进行改造尤为重要。 抗菌肽的介绍 抗菌肽是一种广泛存在于生物界的抵抗病原微生物入侵的小分子多肽，是生物先天免疫的重要组成部分，具有广谱抗菌活性和抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及免疫调节等生物活性，其区别于传统抗生素的独特作用机理，使其不易产生耐药性，是一类极具潜力的肽类抗生素 。 抗菌肽的改造 对含有线性a-螺旋结构的抗菌肽改造 对含有b-折叠的抗菌肽的改造 对含伸展片层结构的抗菌肽的改造 对环形抗菌肽的改造 材料、试剂、仪器 实验材料：中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤抗菌肽Temporin-1CEa及其类似物（LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3），MCF-7细胞,人类血红细胞,三氟乙醇（TFE），十二烷基磺酸钠（SDS）； 实验试剂：生理盐水，蒸馏水，RPMI-1640，小牛血清，胰蛋白酶， MTT，DMSO，0.1%TFA 超纯水溶液、0.1%TFA 乙腈溶液； 实验仪器：倒置显微镜，酶标仪，CO2培养箱，荧光酶标仪（Thermo）；Jasco-810型圆二色光谱仪；UV-7504PC型紫外可见分光光度仪（上海欣茂仪器有限公司）；FA2004型分析天平（上海天平仪器厂）；恒温水浴锅, 超净工作台，高速台式冷冻离心机。 Temporin-1CEa类似物的设计 由于Temporin-1CEa的阳离子性较弱，并且对红细胞的毒性作用较强。所以通过赖氨酸（K）替换Temporin-1CEa中的中性氨基酸残基，以及带负电氨基酸残基以增加阳离子性，并且相对改变疏水值。 采用CD光谱测定几种改造肽的α螺旋含量 将抗菌肽temporin-1CEa及其类似物样品分别溶于水、 50%（v/v）三氟乙醇（TFE）的水溶液、 30mM SDS的水溶液，使样品终浓度达到0.3 mg/mL。以此来测定几种改造肽的a螺旋含量。 通过高效液相色谱测定保留时间来表征改造肽的疏水性 抗菌肽的疏水性越大越容易透过红细胞发挥作用，因此疏水性越大药物作用越好。 利用MTT方法检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对MCF-7细胞增殖的抑制率 采用溶血实验检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对人红细胞的溶血率 讨论 抗菌肽的发展目标是优化的疏水性，最大限度地减少真核细胞的细胞毒性，并最大限度地发挥抗菌活性，这反过来又优化治疗效果。　在抗菌和溶血活性方面疏水性作用和净正电荷有重要性。此外，我们已经证明，疏水性有一个临界值，可取得最佳的抗菌活性。也就是说，减少对非极性面肽的疏水性，能降低抗菌的活动；同时增加肽的净正电荷，提高抗菌活性直到达到最佳，进一步提高疏水性超出最佳范围，就会减少抗菌活性。 本文研究以Temporin-1CEa为模板，对其阳离子性进行改造，成功的设计了4种Temporin-1CEa的类似物：LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3。其中LK2(6)最好，IC50值最低溶血活性很小，净正电荷是多数天然抗菌肽的重要特征,是影响其与膜上基团识别结合的关键。多数致病菌和病变细胞的细胞膜呈电负性,在抗菌肽穿膜过程中,一般认为抗菌肽首先通过静电相互作用结合在膜上,随后疏水结构域插入到膜中,或破坏膜,或形成离子通道,致细胞死亡。 感谢 大学本科的学习生活即将结束。在此，我要感谢所有曾经教导过我的老师和关心过我的同学，他们在我成长过程中给予了我很大的帮助。本文能够顺利完成，要特别感谢我的导师王澈老师还有，感谢在坐各位的老师的关心和帮助。 最后向所有关心和帮助过我的人表示真心的感谢。 “备”则“倍” 有准备、有规划的人生更精彩！ * 学生：于淼 指导老师：王澈 副教授 0.750 10.9118 2032.61 FKKLKKIANIINSIFKK-NH2 +7 LK3 0.750 11.5353 2003.57 FVKLKKIANIINSIFKK-NH2 +6 LK2（6） 0.755 10.8412 2019.5