LPS直接诱导的肺微血管内皮细胞对PMN的粘附、趋化作用及其通过NF-κB调控机理的实验的分析.pdfVIP

LPS直接诱导的肺微血管内皮细胞对PMN的 B调控机理的 粘附、趋化作用及通过NF．K 实验研究 摘 要 祷。黔革兰氏阴性细菌引起的脓毒综合征，实际上就是伴有严 重感染的全身炎症反应综合征(SIRS)，极易导致多器官功能障碍 综合征(MODS)的发生。肺是最易受损伤的靶器官，主要表现是 急性肺损伤(ALl)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发生。f多 程中的早发事件，是介导肺广泛炎症反应、肺组织损伤的关键所在。 然而有关PMN于肺内“扣押”的机制，目前仍知之甚少。Doerschuk 等在病理检查中观察到95％以上的“扣押”PMN是在肺毛细血管 网内，仅5％左右在肺动、静脉内，PMN迁移至肺组织最初也发生 在肺毛细血管。 肺微血管内皮细胞(PMVEC)作为肺毛细血管的主要构成成 分，介于血液和组织之间，不仅仅是一道简单的物理性屏障，还具 有多种生理学功能。在PMN的肺内“扣押”中必然起着重要的作 用，但有关研究却甚少报道。 目的：?本文通过培养PMVEC，以LPS为诱导因素，模拟脓毒 综合症反应中LPS对PMVEC的直接激活作用。研究其细胞间粘 B(NF— 附分子一1(ICAM-1)和IL一8的表达变化及核因子一kappa KB)的活化，从而探讨以PMVEC为中心介导的PMN肺内“扣 押”发生的物质基础及其核调控机制。 Ⅶ ／方法：1．用免疫细胞化学、原位杂交、ELISA方法分别检测 PMNEC在不同时相、不同浓度LPS直接作用刺激下ICAM-l的表 达、IL．8mRNA的表达及蛋白的分泌。同时检测PMVEC对PMN 粘附率、趋化指数及分别用Anti．ICAM．1、Anti．IL-8抗体处理后 对各自的影响；采用扫描电镜静态观察PMVEC．PMN的粘附。 2．凝胶电泳迁移率分析(EMsA)检测LPS直接作用诱导的NF— xB的活化及免疫细胞化学检测p65、p50亚基的转核。并迸一步 观察加入活化阻断剂TPCK后对上述各指标的影响。 结果：1．LPS直接刺激PMVEC可诱导ICAM一1的表达增加。 LPS刺激6小时 LPS刺激2小时或1ng／ml 与对照组比，100ng／ml 的表达随LPS刺激的时间、剂量增加而增加。 2．LPS直接刺激可促进PMVEC对PMN的粘附率增加，且其变 化在时间与方式几乎与ICAM．1的表达增加同步。Anti—ICAM．1抗 体可以显著地抑制LPS诱导的PMVEC．PMN粘附。与无抗体抑制 LPS刺激6小时粘附率的抑制达到57．2％ 组比，对100ng／ml (P0 01)。表明可能是由于IcAM．1的表达增加，为粘附提供了 物质基础。 3．扫描电镜直观地显示了PMVEC．PMN粘附的超微结构表现， tethering) 并且首次通过这种方式观察到“间接系链”(Secondary 现象的存在。“间接系链”的发生更扩大和巩固了粘附效果。 4．LPS直接刺激能显著促进PMVEC表达IL．8，包括促进 IL-8mRNA的表达及IL．8的分泌。在时间上mRNA的表达增高先 于IL．8的分泌。 5．LPS直接刺激能显著促进PMVEC对PMN的趋化作用，而抗 IL一8抗体能显著的抑制这种趋化作用。表明可能是由于促进了lL一8 的分泌，从而为PMN的迁移提供必需的物质条件。 6．EMSA显示LPS的直接刺激能迅速促进NF．KB的活化转核。 Ⅷ B已发生显著活化，至1 1LPS直接作用30分钟，NF．K 100ng／m