猪链球菌噬菌体SMP地抑菌作用和其增殖动力学研究.pdfVIP

或噬菌体的基因组发现，SMP 虽然保守区段很多，但却很短，其中主要 有 int、lysin 等基因，而 single strand binding gene 在 blast 结果中显得最保 守。针对single-stand binding gene 序列设计引物，建立了 PCR 检测方法， 可在猪链球菌和噬菌体 SMP 的目标区段检测到条带，回收测序证明是目 标条带，而在对照组大肠杆菌及其噬菌体中未发现条带。通过优化 PCR 3cfu/mL 。应用该方法可以同时筛选到噬菌体 反应条件，检测下限可达 10 和相关宿主菌，可提高噬菌体的分离概率。进一步通过 200nm 滤膜过滤， 可实现噬菌体和细菌的分离，并可通过下述的噬菌体快速荧光定量 PCR 检测技术确认噬菌体的存在。通用检测可实现对猪链球菌 2 型烈性噬菌体 有无的快速初步鉴定，甚至溶源阶段的噬菌体也可以检测。利用该方法， 可加快噬菌体的分离工作，比传统的“盲传”分离更加高效。另外，通用 检测方法可以应用到前噬菌体分析中，这是首次提出用 PCR 进行猪链球 菌前噬菌体检测。 为了评估烈性噬菌体在动物实验中对猪链球菌 2 型的抑菌作用、研究 噬菌体和猪链球菌 2 型互作后各自的消长情况，以评价烈性噬菌体对感染 猪链球菌动物的保护力，针对猪链球菌 2 型及其噬菌体 SMP 分别建立了 快速荧光定量 PCR 检测技术。本文使用猪链球菌溶菌酶释放蛋白 （Muramidase-released protein, MRP ）毒力基因mrp 作为猪链球菌检测的 目标基因 。结果显示，猪链球菌快速荧光PCR 检测技术可以在 30 分钟 内把猪链球菌2 型鉴定出来并实现定量，定量的下限低于 30 个模板每毫 升，特异性实验显示它可以很好地排除大肠杆菌及其噬菌体、枯草杆菌、 7 金黄色葡萄球菌和其自身噬菌体 SMP 等的干扰。 在噬菌体 SMP 快速荧光定量 PCR 检测中，选用 lysin 作为目标基因， 同样噬菌体SMP 快速荧光 PCR 检测可在 30 分钟内鉴定出 SMP 并实现定 量，定量下限低于 30 个模板每毫升，特异性实验显示它可以很好地排除 大肠杆菌及其噬菌体、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌等的干扰。 结合噬菌体 SMP 快速荧光定量 PCR 检测和猪链球菌与噬菌体通用检测， 把猪链球菌与噬菌体通用检测作为一级检测、噬菌体 SMP 快速荧光定量 PCR 检测作为二级检测，可以很方便地检测到猪链球菌噬菌体，为噬菌 体分离提供便利。 通过计算噬菌斑、平板裂解、细菌与噬菌体共培养后的浊度测定可定 性了解噬菌体 SMP 的杀菌能力。为了进一步定量分析细菌与噬菌体的互 作动力学特征，本文进行了细菌与噬菌体共培养的定量实验。将猪链球菌 2 型与噬菌体 SMP 共同培养，每隔一定时间取样，使用荧光定量 PCR 测 算细菌与噬菌体的数量。为了更好地研究噬菌体与其宿主菌的动态关系， 定量实验中建立了捕食者数学模型，并根据定量实验的数据，拟合出结果。 定性实验和定量试验都显示噬菌体 SMP 具有良好的杀菌和抑菌能力，这 为 SMP 的治疗性应用提供了可能。数学模型拟合结果显示 SMP 与其宿主 菌可以适用捕食者模型，首次提出用生态数学模型来模拟微生物之间的关 系，为噬菌体与其宿主菌的互作关系研究提出一条可行性路线，为应用噬 菌体治疗提供了理论基础。 为了研究噬菌体 SMP 对猪链球菌感染的治疗作用，确认 SMP 对感染 8 猪链球菌 2 型的动物具有保护力，进行了小鼠攻击保护试验。以 CD1 小 鼠作为模式动物，在用猪链球菌攻击后，采用静脉注射SMP 进行噬菌体 体内抗菌活性研究。通过统计噬菌体处理组和细菌攻击对照组小鼠体内的 细菌增殖情况，揭示了噬菌体对活体动物具有杀菌效果。试验研究了噬菌 体 SMP 对猪链球菌 SS2-4 的抗感染效果。将小鼠分为4 组，分别是 PBS 阴性对照、噬菌体对照、细菌攻击对照、细菌攻击后噬菌体处理。采用尾 静脉注射，每隔一定时间眼眶采血，连续观察不同组中细菌和噬菌体数量 的变化。结果表明，噬菌体对猪链球菌有杀菌作用，噬菌体能加速小鼠体 内的细菌减少，同时会降低细菌高峰期的峰值，对小鼠存在明显的保护作 用。CD1 小鼠感染猪链球菌后通过注射 SMP 可显著降低血液中猪链球菌 数量的事实提示，S