第6章 分子生物学技术.pptVIP

常用于预杂交的封闭物 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard’t溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 二、核酸探针 指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。 核酸探针的类型： 寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、单链DNA探针。 常用的探针标记物： 放射性同位素（3H、32P、35S、125I）；非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）。 三、核酸分子杂交信号的检测 放射性同位素标记探针： 放射自显影。 非放射性同位素标记探针： 偶联反应+显色反应。 四、核酸分子杂交技术 固相杂交：结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。 液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。 （一）膜上印迹杂交 将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程称为膜上印迹杂交。 印记的方法： 虹吸印迹法；真空转移法；电转移法 DNA或RNA ↓ 电泳分离核酸片段 ↓ 转移至固相支持物（印迹技术） ↓ 杂交 ↓ 洗去未杂交探针 ↓ 杂交信号检测 Northern 杂交 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。 应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。 方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析 Western印迹杂交 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 适于核酸样品定量检测。 （二）原位杂交 用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。 原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。 取材 ↓ 组织、细胞固定 ↓ 预杂交 ↓ 杂交 ↓ 放射自显影或免疫酶法显色 ↓ 观察结果 （三）液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 待测RNA样品 ↓ 液相杂交 ↓ DNA-RNA杂交双链 ↓ 酶解 ↓ 杂交体系纯化 ↓ 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 放射自显影 核酸酶S1（专一降解未杂交的DNA和RNA单链） ← ←单链DNA探针（M13体系合成） 待测RNA样品 ↓ 液相杂交 ↓ RNA-RNA杂交双链 ↓ 酶解 ↓ 杂交体系纯化 ↓ 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 放射自显影 ← 单链RNA探针 RNA酶（专一降解未杂交的RNA单链） ← 聚合酶链式反应：在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。 第三节 PCR技术 PCR反应的特点 特异性强：引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性。 灵敏度高：指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速：2-4 小时完成扩增。 对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~ 95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~ 70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和 缓冲液等。 1、模板（template） 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。 模板DNA需较高的浓度 RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDN