分子生物学大实验_目的基因的克隆及其表达.docVIP

分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达 第一节 基因操作概述 2 一、聚合酶链式反应(PCR) 2 二、质粒概述 4 三、凝胶电泳 5 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 6 五、重组质粒的连接 7 六、限制性内切酶消化 7 七、SDS蛋白质电泳 7 第二节 材料、设备及试剂 7 一、材料 8 二、设备 8 三、试剂： 9 第三节 操作步骤 10 一、目的基因的获得： 10 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： 11 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 12 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定 13 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS电泳。 14 六、融合蛋白的毒力测定 16 第四节 本实验的实验报告 16 第一节 基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。：(1)(Denature)：DNA片段在94℃下解链；(2)(Anneal)：(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)(Extension)：Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，DNA为模板进行合成。，DNA扩增一倍，DNA又可作为下一轮循环的模板，25～35DNA扩增达106倍。　　（一）、PCR反应中的主要成份　　1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，(2)引物中G+C含量通常为40%～60%，Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(4)3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，(6)两引物之间尤其在3端不能互补，，(7)引物5端对扩增特异性影响不大，。5端限制酶位点外再加1～2(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2～10μmo L /L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，　　2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，。dNTP5～10mmol/L，20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20～200mol/L。 3、Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，，，Mg2+浓度范围为0.5～2mmol/L。PCR反应，0.1～5mmol/LMg2+进行预备实验，Mg2+浓度。 4、模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，DNA可以是单链分子，，，(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。DNA而言，PCR的主要因素是模板的数量和纯度。102～105，，0.1μg的人基因组DNA，10ngDNA，1ngDNA。，。PCR可从一个细胞，，DNA中分析目的序列。。DNAPCR的效率。　　5、Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，9540min，975min。DNA聚合酶，。Taq DNA74℃下，30min，10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA，PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环。在100μlPCR反应中，15～2Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。，　　6、反应缓冲液：反应缓冲液一般含10～50mmol/LTrisCl(20℃下pH8.3～88)，50mmol/LKClMg2+。TrisCl在20℃时pH为8.3～88，PCR反应中，pH6.8～78。50mmol/LKCl有利于引物的退火。，5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，　　（二）、PCR反应参数　　1、变性：在第一轮循环前，94℃下变性5～10min，DNA完全解链，Taq DNA聚合酶(hot start)，，PCR失败，DNA双链会很快复性，DNA产量。94℃1min。在变性温度下，DNA解链只需几秒钟即可完全，　　2、退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高，，，37℃～55，1～2min　　3、延伸：延伸反应通常为72℃，Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。，，Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃～85。　　4、循环次数：当其它参数确定之后，DNA浓度。一般而言25～30，PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25～30，Taq DNA聚合酶已经不足，，DNA片段通过重组DNA技术，(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。　　质粒(