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转基因步骤：2-3月完成
引自：A protocol for Agrobacterium-mediated transformation
in rice
水稻幼胚愈伤组织的培养
1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒2min。
2.倒去乙醇，再用1.5%次氯酸钠消毒30min，无菌水洗5次，再用无菌水浸泡30min。
3．倒去次氯酸钠，将种子倒到无菌滤纸上吸干，再将种子放在N6D培养基上29.5度光照培养3-4周。
农杆菌的准备
4．选择有活力的愈伤组织（相对干的、淡黄色的。如图1）转到新的N6D培养基上，29.5度光照培养3天。
注: 褐色的愈伤千万不能选，不然会影响转化效率。
5．挑取含有目的基因的农杆菌单菌落转到AB培养基上，根据载体的抗性选择合适的抗体，28度培养3天。
农杆菌的侵染
6．挑取农杆菌放入30ml AAM感菌液中（含有30ul 1000*AS），轻轻混匀使OD600=0.05-0.1。
7． 将愈伤放入无菌不锈钢筛子中，外面套上一个小的塑料盆（图2）。
8．将步骤6中农杆菌液倒入步骤7中的塑料盆中，侵染90s，其中不停要摇晃。
9．弃菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干。
注：这步特别重要，因为过多的农杆菌会抑制愈伤的生长
10.把无菌滤纸放在2N6-AS培养基上。再把含有30ul 1000*AS的1mlAAM滴在无菌滤纸上，把侵染过的愈伤放在滤纸上。
11．28度暗培养48-60h。
抗性愈伤的筛选
12.把愈伤取出，放入50ml的离心管中，加无菌水5-8次，其间不
地震荡，直到水清澈为止就不用换水了。
13.将愈伤放入不锈钢筛中，外面套上塑料盆，用含有500mg/l Car无菌水清洗。
14.将筛中的愈伤倒在无菌滤纸上沥干。
注: 除去过多的水对愈伤的正常生长非常重要。
15.将愈伤转到N6D-S上，每皿最多16粒。
16.29.5度光照培养3-4周（图3）。
17.再将愈伤转到MS-NK培养基上，长根。
18.29.5度光照培养3-4周。
19.将根长3-4cm的幼苗跳出，转入MS-HF培养基上。
20．再转移到土中培养。
药品：
70% 酒精、1.5%次氯酸钠
100* N6-vitamins： Dissolve 100 mg glycine（甘氨酸）, 25 mg nicotinic acid（烟酸）, 25 mg pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇） and 50 mg thiamine hydrochloride（盐酸硫胺素） the volume to 500 ml withdistilled water. Store at 4 1C.
20* AB buffer Dissolve 60 g dipotassium hydrogenphosphate（K2HPO4） and 20 g sodium dihydrogenphosphate dihydrate（NaH2PO4?2H2O） in 800 ml distilled water; Adjust the pH to 7.2 and adjust the volume to 1 liter with distilled water and autoclave. Store at room temperature (20–25 C)
20* AB salts Dissolve 20g ammonium chloride（NH4Cl）, 6g magnesium sulfate heptahydrate（MgSO4?7H2O）, 3g potassium chloride（KCl）, 240 mg calcium chloride dihydrate（CaCl2?2H2O） and 50 mg iron (II) sulfate heptahydrate（FeSO4?7H2O） in 800 ml distilled water; adjust the volume to 1 liter with distilled water and autoclave. Store at room temperature.
1,000* AA-1 Dissolve 1g manganese (II) sulfate pentahydrate（MnSO4?5H2O）, 300 mg boric acid（H3BO3）, 200 mg zinc sulfate heptahydrate（ZnSO4?7H2O）, 25 mg disodium molybdate (VI) dihydrate（Na2MoO4?2H2O）, 2.5 mg copper (II) sulfate pentahydrate（CuSO4?5
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