开题报告大肠杆菌噬菌体分离纯化研究.doc

陇东学院生命科学与技术学院 本科学士学位论文开题报告 题目：大肠杆菌噬菌体分离纯化研究 学 院：生命科学与技术学院 专 业： 生物科学 班 级： 10级生科（1）班 姓 名： 郑小云 指 导 教师： 毛宁 2013 年 5 月 12日 大肠杆菌噬菌体分离纯化研究 一、选题的目的和意义3至8天，平均为3至4 天。大多数病人10天内康复，但是有少数病人（特别是幼儿和老年人）的染病可能发展为威胁生命的疾病，例如溶血尿毒综合症（HUS）1ml样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确。 Ca2+和Mg2+能够促进噬菌体的吸附与注入[2]，有利于噬菌体的繁殖，对促进噬菌体的形成有明显效果，所以在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，可以提高噬菌体的出斑率。 三、国内外研究概况 英国细菌学家和内科医生Frederick Twort和法裔加拿大细菌学家Flix DHerelle分别在1915年和1917年独立发现了噬菌体，不久之后就用来治疗感染性疾病。Dherelle最早从来自痢疾的临床样本研究中观察到噬菌体滴度的增加正好伴随着病人的康复过程。他将噬菌体称为“外源性免疫因子”[3] 。1934年美国科学家报道了利用噬菌体疗法治疗肠球菌感染的成功率可达80% [4] 。但随着抗生素的成功推广应用，二次世界大战之后美国和西欧的大多数国家都终止了噬菌体制剂的研制。近年来细菌耐药性问题不断突现，用抗生素治疗细菌感染面临巨大的挑战，一些科学家和临床工作者开始重视噬菌体制剂的研制。研究者Harper解释了为什么噬菌体疗法现在又被重新使用起来了，因为每一个噬菌体对某种类型的细菌有高度的特异性，而且它们需要正确的宿主细胞才能够进行复制。靶细菌越多，噬菌体的繁殖速度越快，越能在最短时间内杀死细菌。因此用噬菌体来治疗大量细菌的感染性疾病变得有可能，比如慢性耳朵感染、肺部感染以及伤口感染等。研究者还表明，对于多种类型的细菌感染，仅仅需要一点点噬菌体就可以治疗感染性疾病。而且我们可以直接用噬菌体型的喷雾剂、滴液或者膏状物来治疗感染，当然了，最主要的好处是噬菌体不会感染人类的细胞，从这点来说，噬菌体治疗方法对于治疗人类的细菌性感染疾病变得非常安全。近年来，日益增加的细菌抗生素耐药性对于我们治疗感染来说越来越困难，而且新型抗生素研发的速度远远赶不上耐药细菌出现的速度。目前研究者正在加速研究噬菌体治疗细菌感染这种疗法。目前，噬菌体疗法的临床试验正在进行之中，第一例临床安全试验是2005年进行的，相关试验结果于2009年已经发表出来了，结果证实了噬菌体疗法的有效性和安全性。研究由Ampliphi公司进行，一旦临床试验成功后，未来，噬菌体的治疗方法将会彻底治疗细菌感染以及细菌的耐药性。 四、研究内容 本实验首先活化培养实验室保藏的大肠杆菌E. coli NO1和E. coli NO2至对数期600nm（OD值0.8左右），然后取大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37℃摇床振荡培养12-14h，以增殖噬菌体。再将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12-18h进行噬菌体富集。继续将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10ml加入 5ml 3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1ml，室温下放置 1h，37℃ 120rpm振荡培养 3.5h，如此这样反复几次富集噬菌体。最后收集大肠杆菌噬菌体测定它的效价、观察噬菌体对不同宿主菌的裂解曲线和Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响。 五、研究方法及步骤 1材料 噬菌体样品来源：阴沟污水（100ml），土壤 菌种：陇东学院生命科学与技术学院微生物实验室保藏的大肠杆菌E. coliNO1和E. coliNO2 培养基： 3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层平板用） 实验器材：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，无菌涂布器，无菌吸管，培养皿，三角瓶，移液管，试管，漏斗等 2方法 2.1大肠杆菌噬菌体的分离 A.培养大肠杆菌：活化培养实验室保藏的大肠杆菌E. c