超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素C1突变蛋白对百草枯中毒作用的分析.pdf

·中文论著摘要· 超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素C1突变蛋白对百草枯中 毒作用的研究 百草枯(paraquat，PQ)是全球广泛使用的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂， 对人畜具有较强毒性，主要表现为肺损伤，且存活人群中绝大多数患者存在肺间 质纤维化。现有研究显示PQ中毒的机制主要有氧自由基损伤、炎症因子网络系 统作用、对细胞膜损害等，其中炎症因子网络系统目前被认为与肺纤维化关系密 原小剂量时可引起T细胞的大量活化激活免疫系统，而大剂量时引起T细胞克隆 enterotoxinCI， 无能和免疫抑制。金黄色葡萄球菌肠毒素C1(staphylococcal SECl)作为由金黄色葡萄球菌产生的一种典型超抗原，具有相对低毒的特点，并 且大剂量应用时，可以抑制免疫反应，使机体处于免疫不应答状态。该特点使其 有潜力应用于百草枯中毒的治疗，抑制机体免疫反应，进而减少全身炎症反应综 inflammationreaction 合症(systemic syndrome，SIRS)及肺纤维化的发生。 实验目的 利用基因工程技术对SECl进行定点突变改造，构建增活减毒型突变蛋白， 并将构建的蛋白应用于百草枯中毒的小鼠体内，探讨SECl对百草枯中毒后的全 身炎症反应综合征以及肺间质纤维化的影响。证明重组SEel能够抑制体内炎症 因子的释放，减少肺组织损伤，下调纤维化相关基因mRNA的表达，抑制肺间质 纤维化。 实验方法 l、SECl增强减毒型突变体ST-1和ST-2的构建 (1)SECl增活突变蛋白S．1和S．2的构建 ①根据野生型SECl的cDNA序列使用Primer5．0软件设计相应突变引物，针 对SECl分子的二硫环内氨基酸进行突变研究。②分别应用突变引物和端引物扩 增出突变位点上游和下游的PCR片段，再以上述PCR片段为模板应用两条端引 物扩增出整条secl突变基因。④将PCR扩增产物进行1．2％琼脂糖凝胶电泳分析@ PCR扩增产物的胶回收@对PCR扩增产物进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定⑥构 建重组表达载体：将上述经双酶切的突变基因PCR产物与经同样酶切处理的表达 载体pET-28a以1：5浓度混合进行IOC过夜连接，重组质粒转化原核宿主， 筛选阳性克隆的PCR进行基因测序。 (2)SECl减毒突变体ST-1和ST-2的构建 ①分别以含有S．1和S．2基因的质粒DNA为模板，通过突变引物以重叠PCR 后筛选阳性重组子，经测序后验证重组表达载体构建成功。②将测序结果正确的 突变蛋白表达宿主菌株进行培养后破碎，破碎产物经结合上柱、杂蛋白漂洗和目 标蛋白洗脱三个步骤处理后得到纯化的目标蛋白。④分别将纯化后的ST-1和ST02 蛋白以SDS．PAGE分离，半干转膜仪转移至硝酸纤维膜，以鼠抗His．tag抗体为一 抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗进行Weaemblotting分析。 (3)小鼠脾淋巴细胞增殖水平的测定 以含10％胎牛血清的RPMll640培养液将脾淋巴细胞加入96孔细胞培养板； Index，PI)表示增值能力，PI--实验组吸光值／阴性对照组吸光值。 (4)ST-1、ST-2致热毒性和催吐毒性的检测 2、ST-1对百草枯中毒后全身炎症反应综合征作用研究 2 小鼠30min后予24mL／kg PBS灌胃；低剂量ST-1组：ST-1溶液以 剂量腹腔注射小鼠30rain后予24mL／kg 胃染毒。 观察小鼠的生存时间。染毒后72h处死小鼠，取血和组织。检测炎症因子 TNF．Q、IL．1 D、IGF．1、PDGF及各组织超微结构变化。 3、ST-1对百草枯中毒致肺间质纤维化作用研究 将BABL／c小鼠，随机分成6组，分别给予下列处理：对照组(CK组)：PBS PBS灌胃；PQ染毒组 溶液以5mL／kg体积浓度腹腔注射小鼠3