实验答辩 药理实验 细胞凋亡.ppt

细胞凋亡（科普诗） 似秋叶的凋零， 告别生命之辉煌； 那难以计数的攻击、诱导， 轻启着道道程序， 逼细胞步步走向生命的末端； 啊，活性氧处处肆虐， 钙波涛惊石裂岸， 线粒体把生命之光一点一点拧淡; 危难中的细胞啊， 你沉稳不乱， DNA片片切割， 化云梯直通天堂； 细胞体分团相聚， 把生命的凝重浓集在小体上； 分别了朝夕相处的伙伴， 再见了快乐美好的时光； 这一切的一切又融入临近的胞体， 腾出的空间再写生命的篇章。 实验技能 本小组成员实验能力较好，均有 三年的实验经验，已做过分子生物学 实验，天然药化实验，微生物实验等 指导老师实验经验丰富，实验水平高 希望在本组成员的合作以及指导老师的指导下，我们可以顺利，成功完成实验 参考文献 2实验依据 Western blot 2实验依据 关键分子： cytc （细胞色素C） 细胞色素C的释放是凋亡发生的关键事件，也是线粒体参与凋亡的主要方式 cytc是第一种被发现的线粒体释放促凋亡蛋白，是线粒体呼吸链的重要组成部分。正常情况下cytc是一个定位于线粒体膜间隙的水溶性蛋白，稳定地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。 线粒体介导的细胞凋亡途径 2实验依据 线粒体外膜 通透性增高 胞质中出现Cyt C 与细胞浆中成分作用 激活caspases 诱导细胞凋亡的发生 如染色质浓缩和核碎裂 线粒体介导的细胞凋亡途径 3实验步骤 细胞准备 取适量对数生长期细胞接种于铺有玻片的24孔板中，每孔3-5万，37℃，5%CO2条件下培养24小时，给药组加入药物诱导适宜时间，对照组加入等量溶剂作用相同时间 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。吸入1.5ml离心管。 超声打碎染色体DNA,直至溶液不粘为止。 4℃，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS，如不能立即做，可将上清转入另一Eppendorf -80°C保存 3实验步骤 注意事项 细胞裂解液的量 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一个孔大约上100ug的总蛋白。 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 未知蛋白应同时作阳性对照。 3实验步骤 3实验步骤 1.制胶 需紧密固定！！ 3实验步骤 每孔上样量为20-50 μg蛋白；根据目的蛋白的表达情况的不同而有所变化。 2.上样 3实验步骤 3.电泳 电泳条件： 推荐：浓缩胶 80V 35——45min 分离胶 120V 45——75min 3实验步骤 考马斯亮蓝染胶 转膜 Western Blot实验 SDS电泳实验 3实验步骤 4.转膜 原理： 蛋白因结合SDS而带电荷，转膜即在电场作用下从胶中转至膜上的过程。 3实验步骤 4.转膜 半干转 湿 转 半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白 湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白 两种方法的转膜液不同！！ 方法 仪器 特点 3实验步骤 4.转膜 PVDF膜、NC膜、尼龙膜特点比较 3实验步骤 4.转膜 转膜准备 3实验步骤 制作“三明治” 4.转膜 3实验步骤 4.转膜 转膜条件： 推荐：100V ，1——2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。 3实验步骤 5.转膜后检测：（丽春红染色） 1x丽春红 5min 染色前 染色后 为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。 3实验步骤 6.封闭 封闭条件： 4°C摇动，封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。 为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，常用的封闭液： 脱脂奶粉（5％） BSA（5％） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 不能用于磷酸化蛋白！ 3实验步骤 1.按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体； 2.抗体孵育时间：室温下孵育1～2h或4℃过夜（一般不超过18小时）； 3. 保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀； 7.免疫反应 结合 一抗 3实验步骤 7.免疫反应 摆床上，二抗杂交，室温（25℃左右）1h，或4℃过夜。 PBST(TBST)洗涤3次，每次10分钟。 结合 二抗 3实验步骤 7.免疫反应 不同二抗稀释浓度的效果图 3实验步骤 8.显色（结果检测） 显色方法 代表类型 特点 酶促底物发光法 DAB显色法 稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般