第八章_外源基因表达产物分离纯化.ppt

D 重组蛋白质的鉴定 一、 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 Sephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒 Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的 1. 离子交换层析 2. 凝胶层析 凝胶过滤的作用机制 3. 亲和层析 亲和层析（affiuity chromatography） 亲和层析原理示意图 4. 膜分离 透析 三、 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 包涵体加工流程 包涵体的洗涤 为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如2mol/L尿素或盐酸胍等，洗涤以除去脂类和膜蛋白。 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA 包涵体的溶解 大多数在pH8的条件下，用强变性剂如8mol/L尿素、 6mol/L盐酸胍，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展 蛋白质复性机理 蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用： 一是分子内的疏水相互作用 →促使蛋白质正确折叠 二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀 一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右 四、重组蛋白质的鉴定 测定蛋白质的浓度 凯氏定氮法 紫外吸收法 分光光度法 测定蛋白质的纯度 鉴定目标蛋白质 蛋白质分子质量与等电点的测定 氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质活性及功能测定 1 蛋白质含量的测定 凯氏定氮法： 蛋白质平均含氮量为16﹪，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量。 紫外吸收法 芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收. 经验公式 蛋白质含量（mg/mL）=1.45× A 280nm — 0.74A 260nm 分光光度法 蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定的波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量 考马斯亮兰法等 2. 纯度鉴定 鉴定方法 色谱纯：在层析图谱中只有一个洗脱峰 电泳纯：在电泳图谱中只有一条电泳条带 结晶纯：能够获得蛋白质晶体 相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此需要互相验证。 3.蛋白质鉴定 分子质量及等电点测定 氨基酸组成及顺序分析 结晶及结构分析 免疫印迹（western-blotting）鉴定 3.1蛋白质分子质量及等电点的测定 分子质量 SDSPAGE 等电点 等电聚焦（IEF） 3.2氨基酸组成及顺序分析 氨基酸组成 水解蛋白质为氨基酸 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定 顺序分析 质谱法 推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列 化学法（手工、自动） 水解法 Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法 3.3 空间结构分析 二级结构的比例 圆二色谱法 三维结构 X射线晶体衍射法—蛋白质晶体 核磁共振—溶液中蛋白质的三维结构 电子显微镜 3.4 免疫印迹鉴定 免疫印迹包括三个步骤 凝胶电泳 转膜 抗原抗体显色反应 求职应注意的礼仪 求职时最礼貌的修饰是淡妆 面试时最关键的神情是郑重 无论站还是坐，不能摇动和抖动 对话时目光不能游弋不定 要控制小动作 不要为掩饰紧张情绪而散淡 最优雅的礼仪修养是体现自然 以一种修养面对两种结果 必须首先学会面对的一种结果被拒绝 仍然感谢这次机会，因为被拒绝是面试后的两种结果之一。 被拒绝是招聘单位对我们综合考虑的结果，因为我们最关心的是自己什么地方与用人要求不一致，而不仅仅是面试中的表现。 不要欺骗自己，说“我本来就不想去”等等。 认真考虑是否有必要再做努力。 必须学会欣然面对的一种结果被接纳 以具体的形式感谢招聘单位的接纳，如邮件、短信 考虑怎样使自己的知识能力更适应工作需要 把走进工作岗位当作职业生涯的重要的第一步，认真思考如何为以后的发展开好头。 Thank you 色谱纯 电泳纯 结晶纯 各类氨基酸自动测序仪 原核细菌表达的重组蛋白产物的质量检测项目与方法 检测项目 检测方法 产品是否含内毒素 家兔热原法 蛋白质是否变异 肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳 甲硫氨酸是否被甲酰化 肽谱、质谱、HPLC、Edman分析 蛋白质是否变性、聚合、脱氨基 SDS、凝胶层析、等电聚焦、质 配体是否脱落 SDS、免疫分析 氨基酸是否发生取代 氨基酸分析、肽谱、质谱、毛细管电泳 产品是否被细菌、病毒、支原体等污染 微生物学检测 谱、HPLC、毛细管电泳、Edman分析 使用特异的配基作为洗脱剂 溶液为洗