新型抗艾滋病海洋药物911单克隆抗体的制备及特性分析.pdfVIP

新型抗艾滋病海洋药物911单克隆抗体 的制备及其特性研究 摘 要 f 911是从海洋中提取分离并经化学修饰而得到的海洋硫酸多糖类化合物，主 家药品监督管理局批准进入了临床研究，目前正处于临床研究阶段。由于缺少 切实可行的评价911人体药代动力学的研究方法，严重阻碍了911的临床研究 进程。f本文旨在通过制备911单克隆抗体，为911药代动力学方法的建立提供 物质基础。 基的醛基与牛血清白蛋白的氨基进行偶联，制备了牛血清白蛋白(BSA)．911 复合物，并分别使用硫酸一苯酚显色法和280nm紫外吸收法测定复合物中9II和 在弗氏完全佐剂的存在下，通过皮下多点注射和腹腔注射等途径，连续多次免 的生成，小鼠血清中的抗体效价可达103。采用还原胺化法，制备了人血清白蛋 高间接ELISA法的灵敏度，使该法适用于单克隆抗体制备过程中的筛选工作。 瓷下，将小鼠脾细胞与对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞(Ns．1)进行融合，在HAT 选择性培养基中进行选择性培养。7．10天后，显微镜下挑出有杂交瘤细胞生长 测，挑出阳性孔。然后以有限稀释法克隆化，反复克隆三次，至100％的孔抗体 反应均为阳性。并转移至完全培养基中扩大培养。在融合初期，以91l。HSA偶 联物为抗原，间接ELISA法检测抗体的生成，最后建立了四株能持续分泌911 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为DD3、DC8、HH9和HC5。 经过大量培养之后，将各杂交瘤细胞接种于降植烷预处理过的Balb／c小鼠 腹腔，以诱发产生含特异性抗体的腹水。7--10天后，抽取腹水，并以91l为抗 原，间接ELISA法检测腹水效价，腹水效价可达105以上，其中HH9腹水的效 p 价可达1矿以上。腹水通过低温高速离心和0．22 m过滤除去脂质和细胞成分。 用饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体，50％、40％、33％饱和硫酸铵依次沉淀 腹水，沉淀稀释1000倍后仍能检测到抗体活性。并用Protein-A亲和柱层析纯 化DD3抗体。制备了能与911特异性结合的单克隆抗体。 进一步对能够分泌911特异性抗体的杂交瘤细胞进行特性研究。结果发现： 1．DNA含量：使用流式细胞仪测定杂交瘤DNA含量，PI染色，四株细胞 的DNA含量均大于脾细胞和NS一1细胞，证明四株细胞均为融合细胞。 2．抗体亚型鉴定：使用IsostripTM试剂盒测定抗体亚型，DD3、DCB、HH9、 HC5抗体亚型分别为lgG2a、I902a、I901和igol，K轻链。 3．抗体特异性研究：使用生物大分子相互作用仪，以911一CM5芯片检测抗 体反应。91l单克隆抗体经9l1阻断试验及竞争性抑制试验证明单克隆抗体对 91I均具有特异性，而且与内源性多糖无交叉反应。 4．稳定性研究：使用生物大分子相互作用仪，以911·CM5芯片检测抗体反 应。杂交瘤细胞系经6个月以上的连续传代及反复冻融3次均能稳定分泌911 单克隆抗体，而且DD3、DC8、HC5三种抗体3TC的保存条件下，三天内仍能 保持活性。 5．亲和力常数测定：经Beaty法检铡DD3的亲和力常数为2．OX10M‘·吐 本文制各911单克隆抗体，今后拟将其应用于911药物代谢动力学的免疫方 法的建立，以期解决911的临床药代问题。f同时为糖类药物人体药代动力学研 究方法的建立提供理论依据。4 关键词：海洋硫酸多糖；9”／_尊克隆抗体： 、√ nation andPurificatlonof Preparation。Determl MonocIonaIAntibodies911 against Abstract Four celllines monoclonal 911