2章菌种110905.ppt

第二章 菌种分离、选育和保藏 第一节 工业菌种的获得 菌种的来源：直接购买、筛选与驯化。 购买：根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买。 筛选：从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种快速、准确、有效地对菌种进行分离和筛选。 筛选方法非常重要，设计选择方案2点 注意：方法的选择性和灵敏度。 菌种筛选主要步骤 调查研究及查阅资料 ↓设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ （一）采样 1、采样对象 以采集土壤为主。 细菌和放线菌：田园土和耕作过的沼泽土中； 酵母和霉菌：富含碳水化合物的土壤和沼泽地中较多，如一些野果生长区和果园内。 （二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以对样品预处理（物理、化学）或配制选择性培养基。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。 2、平皿反应快速检出法——定性或半定量 （1）透明圈法 根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量。 淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶 （2）变色圈法：直接用显色剂或指示剂 （3）抑制圈： 适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：获抗G+菌抗生素的菌株,工具菌可使用金黄色葡萄球菌 方法 代谢物积累：用打孔器（3CM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低 目前，人们可以利用的微生物只占自然界的1％左右。已经证明大量的微生物在人工合成的培养基上无法生长。这就迫切要求不依赖于微生物培养而能进行微生物研究的新技术出现。 2种研究方法：模拟自然培养法和宏基因组分析。 模拟自然培养法：模拟微生物生长的自然环境对未培养微生物进行培养研究，主要集中在原位培养、培养条件的优化、单细胞微操作的研究。 宏基因组分析： Handelsman（1998）依据基因或基因组、蛋白序列，以及调节表达机制构建高效表达的工程菌株。不经纯培养也可以获得菌的信息。 宏基因组分析法 宏基因组分析法：直接依据基因或基因组、蛋白质序列，以及调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用。 刃天青是一种氧化还原指示剂 厌氧微生物的培养基制作 （1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（氧化还原电位 ） 煮沸法：将培养基置煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下 培养基预还原：加入半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh （2）创造无氧环境 物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐抽真空76mmHg→充入N2→充入CO210%+H2 10% + N280% 化学除氧 H2 + O2 → H2O (钯作催化剂） Gaspak罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 厌氧培养装置 （3）厌氧分离（培养）设备 高层琼脂柱技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术 好氧培养培养装置 （四）扩大培养 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素是生长在食物及饲料上的黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物。 致癌：黄曲霉毒性的致癌性极强。除极易导致肝癌外，由于给毒途径不同，还可引起肾、胃、支气管、腺体和皮下组织的癌肿。 致畸：4mg/kg/1次，妊娠地鼠腹腔有致畸现象。 致突变：典曲霉毒素B1可使动植物细胞染色体畸变带有桥、染色单体桥和染色单体断裂及DNA断裂。 二、放线菌的分离 除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般培养4-20 d 在分离平板上缓慢形成菌落。 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂抑制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。 次代培养及纯化 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分 镜检 三、真菌分离 1、利用低C/N比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。 2、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。 3、加抗生