基于单克隆抗体的多元弧菌免疫学检测技术的研究.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * 第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立 6.3 流式细胞术检测弧菌的准确性与检出限 对菌体浓度在104~107 cells/mL内的样品2~样品5的检测结果表明，流式细胞术与平皿菌落计数法的检测结果显著相关(P0.01)，相关系数r=0.9920，检测值可信度较高。对于浓度低于104 cells/mL的样品1，两种方法的检测结果有较大偏差(80.7%)。FCM法检测弧菌的最低检出限为104cells/mL。 图6- 4 FCM检测值与平皿菌落计数值的对比图 □流式细胞术；■平皿菌落计数 * 第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立 6.4 流式细胞术检测弧菌的特异性 图6- 5 FCM检测多元弧菌的荧光信息直方图 * 第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立 FCM方法可特异性识别5种病原弧菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌），而与6种海水中常见非弧菌（嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、普通变形杆菌）无交叉反应，显示出该方法具有良好的特异性。 图6- 6 FCM检测非弧菌的荧光信息直方图 * 第六章 多元弧菌流式细胞术检测方法的建立 6.5 流式细胞术检测弧菌的精密度 表6- 2 精密度试验 样品编号 Mean±SD 变异系数（%） 1 36837±2504 6.8% 2 436885±17912 4.1% 对1号（5×104 cells/mL）、2号（5×105 cells/mL）样品每天进行一次FCM分析，每次做三个平行，一共测试5天，结果分析见表6- 2。每个浓度下的变异系数均小于7%，变异较小，表明该方法具有较好的精密度。 * 结论 对溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌的OmpW蛋白质序列进行序列比对分析表明，不同弧菌种内OmpW蛋白质序列的平均一致性分别为：溶藻弧菌96.0%，副溶血弧菌100%，哈维氏弧菌95.3%。在不同种弧菌种间：溶藻弧菌与副溶血弧菌、哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为93%、90.1%；副溶血弧菌与哈维氏弧菌OmpW蛋白质序列的平均一致性为89%。生物信息学分析表明，OmpW是多种弧菌种内、种间高度保守的外膜蛋白，可作为多种弧菌共同的菌体表面抗原。 以提取的副溶血弧菌标准株V.parahaemolyticus 1.1997基因组DNA为模板，成功克隆到OmpW成熟蛋白的编码基因序列，并构建了pET28a-ompW重组质粒，转化大肠杆菌E.coli BL21。在IPTG诱导下，导入pET28a-ompW重组质粒的重组菌E.coli BL21大量表达了预期分子量（27kDa）的重组蛋白。通过镍柱Ni-IDA纯化，重组蛋白r-OmpW达到电泳纯。 * 结论 分别将重组蛋白r-OmpW和甲醛灭活的副溶血弧菌全菌免疫小鼠，制备抗血清。抗重组蛋白r-OmpW血清在免疫印迹中识别了重组蛋白，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。抗r-OmpW血清识别副溶血弧菌全菌与抗副溶血弧菌全菌血清识别r-OmpW两个实验的结果表明，重组蛋白r-OmpW和天然蛋白OmpW具有相似的免疫反应性，能在机体内激发相似的免疫反应。 将r-OmpW免疫后的BALB/c小鼠，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合。将副溶血弧菌作为包被抗原，使用间接ELSIA方法对杂交瘤细胞进行初筛。分别使用5种病原弧菌作为包被抗原对初筛得到的杂交瘤细胞进行复筛，获得杂交瘤细胞株S5C10。杂交瘤细胞株S5C10具有良好的抗体分泌稳定性，其分泌的单抗免疫球蛋白的亚类属IgG3，腹水单抗效价达到1:4.6×104，可特异性识别5种病原弧菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌），而与9种非弧菌（嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌）无交叉反应，表现出良好的特异性。 * 结论 建立了基于单克隆抗体的多元弧菌流式细胞术检测方法，优化了一抗（单抗）的反应浓度和时间，并对该方法进行了初步评价。该方法检测过程需2h左右，当菌浓在104~107cells/mL范围时，FCM法检测值可信度较高；可特异性识别5种病原弧菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌），而与海水中常见的6种非弧菌（嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、大肠杆菌、普通变形杆菌）无交叉反应；对含不同菌体浓度的样品进行重复检测，变异系数CV值均在7%以内。本方法操作简单，耗时较短，特异性高，具有较好的准确性和稳定性，为多元病原弧菌的检测提供了新的方法。 * 创新之处 以重组蛋白r-OmpW为小