第九章酶免疫技术精品.pptVIP

酶免疫技术 抗原抗体反应 + 酶高效催化作用 酶免疫技术的分类 酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体 酶免疫技术 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 ---- ELISA 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 　　　　　　 Ag Ab Ag Ab(限量)+　　　→ 　　　　　　 Ag-E 　Ab Ag-E 异相酶免疫测定（enzymeimmunoassay,EIA） 基本原理：在抗原抗体反应后，先将抗原抗体复合物与游离的酶标抗体分离，再测定酶标记的复合物催化底物显色的活性，最后推算出样品中抗原的含量。 液相EIA：分离剂分离游离的和结合的标记物。 固相EIA：固相载体结合酶标复合物，经洗涤去除游离的酶标抗体。如ELISA。  酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 评价： 评价： 简化操作，缩短反应时间； 特异性和灵敏度更高； 但抗原过量时，出现高剂量钩状效应（ HD-Hook效应），导致结果偏低甚至假阴性结果。 采用双抗原夹心一步法检测抗HIV ----“钩状效应”所致的假阴性问题。 1.原因：HIV感染者中有些抗体滴度很高，采用可出现双抗原夹心一步法检测，可出现类似双抗体夹心一步法检测抗原的“钩状效应”现象。 2.措施：在血站筛检献血员时，应使用二步法试剂盒进行检测，或是对标本进行双份同时检测，一份原标本，一份1:10或1:100稀释标本，从而避免漏检。 3.双抗原夹心法测抗体（抗HBsAg） 4.间接法 5.竞争法（ HBcAb、 HBeAb ） 5.竞争法 判断时结果时，颜色赿淡表示标本中抗原含量越多。 小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。 6.捕获法 6.捕获法 三、试剂组成： 1、免疫吸附剂：　已包被抗原或抗体的固相载体 固相载体： 　1）要求：吸附性能好、不参与化学反应，不影响抗原或抗体免疫学活性、空白值低且透明度高。 　2）常用载体： 　聚苯乙烯：较强的吸附蛋白质的性能，不损伤抗原或抗体的免疫学活性。 　聚氯乙烯：对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 3）常规检查： 　以一定浓度的人IgG（一般为10ug/L）包被ELISA各孔后，每孔加入适当稀释的酶标抗人IgG抗体，按ELISA的操作步骤进行保温、洗涤、显色、终止反应，测定每孔的吸光度，计算平均值和CV%，CV%应小于10%。 注意： 每孔总体积约360ul，若包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可非特异吸附蛋白，而导致假阳性结果。 2、酶与酶作用底物 A、用于标记酶的要求： 酶活性高 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性 酶催化底物后信号易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 酶及底物理化性质稳定，安全无害，价廉 B、常用酶及其底物 a.辣根过氧化物酶（HRP） b. 碱性磷酸酶（AP） 常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。 * AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。 四、操作要点 1.标本的采取和保存 1）可作标本广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可。 2）避免溶血：血红蛋白具有过氧化物酶活性，因而可能会增加非特异性显色。 3）用新鲜标本：污染的细菌可能含有内源性辣根过氧化物酶。 4）标本凝集不全：残留纤维蛋白原，易造成假阳性。 1.标本的采取和保存 5）肝素、EDTA、酶抑制剂（如NaN3)等可干扰ELISA测定。因此尽量不用肝素或EDTA抗凝血；血清中不要加入NaN3进行防腐处理。 6）标本保存：血清置4℃冰箱5天内完成测试；一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，否则IgG形成二聚体造成假阳性。 7）ELISA的灵敏度1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本，最起码应先做免疫后做生化 。 2.试剂的准备 测试之前，冰箱内试剂一定要复温（至室温）； 并检查是否已经变质； 同时用双蒸水稀释浓缩的洗涤液和稀释液，若用不合格的蒸馏水则可使空白值增高。 3. 加样： 3次加样，即加标本、加酶结合物、加底物