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反义寡核苷酸和红细胞3’一端增强子对 内皮素基因表达的影响 导师 王迪浔教授王建枝教授 研究生 杜云鹏 全文摘要 f I内皮素(ET)是近年发现的一种内源性缩血管活性肽及有丝分裂 原，、是目前所知作用最强的长效血管收缩因子，主要分布于心血管系 统，也广泛存在于肾、肺、脑、肝、子宫以及皮肤等全身多种组织。 大量研究表明，内皮素参与细胞收缩、分泌、增殖等反应，是高血压、 肺心病、心肌缺血、肾衰、哮喘、休克、动脉粥样硬化．慢性肺动脉 高压等许多病理过程和疾病的重要致病因子。最近研究发现，ET广泛 存在于中枢神经系统，尤其ET一1，作为一种新的神经多肽．参与血压 的调节和心血管疾病的发病机理。 反义寡核苷酸(ASODN)是根据碱基互补原理设计的与目标靶遗传物 质(DNA或RNA)特定互补的短核苷酸片段，能从基因转录和／或剪切、 拼接及翻译等多个环节特异性阻断目标靶基因的表达，有可能用於洽疗 与该基因有关的疾病。我室设计了针对ET—l前体基因的反义硫代寡核 苷酸．它可抑制培养的内皮细胞生成ET一1，本文采用正常、腹主动脉 狭窄一一高盐摄人型高血压和慢性缺氧性肺动脉高压大鼠模型及培养的人 脐静脉内皮细胞，研究该片段对大鼠部分心血管中枢ET—lmRNA表达、 ET一1生成，大鼠体动脉压、肺动脉压及常氧和缺氧内皮细胞内皮素基 因表达的影响．以此为内皮素相关疾病提供新的基因治疗途径。 缺氧条件下．细胞可以通过改变基因的表达产生应答反应，以维持 其稳态。研究发现。缺氧可以上调某些基因的表达，其中包括红细胞生 成素(Epo)、血管内皮生长因子(VEGF)、转录因子、内皮素一1等、 这种基因的缺氧诱导性表达调控是通过特异的反式作用因子与DNA上 的氧调节性顺式作用元件结合而实现的。近年来，一种顺式缺氧诱导增 强子片段被定位于红细胞生成素(Epo)3-端增强子中，被认为此片段 I刊济医科大学博l学位论止 与多种细胞的缺氧性反应有关，并发现缺氧可诱导产生一种具DNA结 合活性的蛋自质一缺氧诱导因子l(HIF-1)，它可与缺氧诱导增强子片 段特异结合，然后调节与缺氧有关基因的表达．这是许多细胞对缺氧反 应的共同环节。血管内皮细胞是体内首先感受缺氧的细胞之■／佗在缺 氧反应中有内皮素基因表达增加和内皮素生成增多等变化：1本文针对内 皮细胞缺氧反应可能存在的这种共同环节，探讨向内皮细胞转入野生型 和突变型Ep03’一端增强子片段对缺氧时内皮细胞ET—l表达的影响，以 阐明缺氧诱导内皮素基因表达的细胞内信号转导的途径。 一、ETASODN对正常和高血压大鼠血流动力学的影响 俄们针对猪和人内皮素一1(ET—1)前体基因反义硫代寡核苷酸片断 (ET2≤SODN)，由上海生工生物工程公司合成，设计筛选出能显著抑制培 养内皮细胞ET—l生成的片段(P0．05)。本实验复制大鼠腹主动脉狭窄 一一高盐摄入型高血压模型。30 左室压 d后，记录平均动脉压(MAP)， 和左室压微分值，计算心率，心输出量和外周阻力，术后20rain，麻醉 后用脑立体定位仪，侧脑室注入ETASODN(治疗组)，或生理盐水(高血 压对照组)．48h后，麻醉后再次记录上述指标。正常大鼠对照组的处 理均同高血压组，另取正常大鼠和高血压大鼠，侧脑室注射荧光素标记 的ETASODN，1h后处死，观察ETASODN的分布和细胞摄取。ET一1 含量的测定采用放兔法(北京邦定公司)。 研究发现：大鼠腹主动脉狭窄一一高盐摄人30d后，发生严重高血 压。高血压大鼠脑干ET—l含量(27．46+0．39)明显高于正常大鼠 注射区较远处有散在分布，ETASODN主要分布在神经细胞内。 结果表明：ET一1参与正常和腹主动脉狭窄一高盐摄入型高血压大鼠 血压的中枢调节机制，ETASODN能抑制大鼠部分心血管中枢ET—l的 。l