基因工程与基因体外表达培训课件.ppt

基因工程与基因体外表达 Genetic Engineering and gene expression in vitro 工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 第二节基因克隆需要特定的载体 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 第三节 基因克隆的过程 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 第四节 真核细胞基因转染 磷酸钙共沉淀法 电穿孔法 DEAE-葡聚糖法 脂质体法 显微注射法 三、PCR技术适合进行基因的定点诱变 5` 5` 3` 3` 5` 5` 3` 3` a b c d 5` 3` 3` 5` 变性、退火 5` 5` 3` 3` 加klenow DNA聚合酶 5` 3` 5` 3` 加入引物a、d 5` 3` 5` 3` 3` 5` 3` 利用基因定点诱变可改变基因工程蛋白的特性 　　 自然界的蛋白质常具有一定的可塑性，当某种蛋白质中的一些氨基酸被改变或删除后，其理化性质发生了改变，但仍能保存其原有生物活性。同时一些蛋白质相互融合后仍保持各自成分的活性。 　　　因此，通过基因突变而引起蛋白质结构与功能的改变是可行的。 　　　　 １、定点诱变可制备长效胰岛素 ①将人胰岛素Ｂ链27位的Thr改为Arg， ②将Ｂ链羧基端氨基化和 ③Ａ链２１位Asn改为Gly后， 其胰岛素的等电点从5.4移至6.8，在生理pH条件下结晶， 从而延迟吸收．其在血浆中的半衰期可延长至35.3小时 ２、定点诱变可制备快速吸收的胰岛素 胰岛素在治疗糖尿病时，吸收非常慢，在注射后1.5至2小时，体内胰岛素还未达到高峰，而且在3-5小时后，其水平仍继续上升。 决定胰岛素在注射部位吸收速度决定于胰岛素结合状态。胰岛素在体内吸收是以单体形式吸收的。而普通的胰岛素在中性情况下多数是与锌结合成六聚体，单体形式非常少。 研究发现多聚体之间形成与其B链的B8、9、12、13、16、23-28位残基有关，因此通过基因突变改变上述位置的氨基酸残基，可减少多聚体形成，提高吸收率。 3、通过基因诱变能增加胰岛素与受体的亲和力 通过对胰岛素结构模型分析，发现胰岛素与受体的结合是有特定空间结构的，因此通过基因诱变，改变一些氨基酸残基的组成，会增加其与受体的亲和力。 第六节 克隆基因在适当宿主细胞内表达 一、在大肠杆菌表达系统 （一）、在大肠杆菌系统表达外源基因需要一些基本要素 1、来自真核细胞目的基因需要改造 2、必须选择用大肠杆菌载体 3、注意目的基因连接在起始密码子之后：表达产物有融合蛋白 和非融合蛋白两种（NdeⅠ：CATATG；NcoⅠ：CCATGG） 4、选择适当的受体菌株和诱导条件 1、融合蛋白较稳定； 2、如果载体携带的一段编码信号肽的基因片段，可产生分泌型产物； ３、可利用融合蛋白中原核蛋白制备的单抗进行亲和层析，便于纯化； ４、可利用融合蛋白中原核部分与表达蛋白之间加入的蛋白酶切位点，可切除原核部分。 表达融合蛋白优点： （二）、提高外源基因表达水平 1、提高外源基因表达水平：启动子结构；调整SD序列 与ATG之间距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加mRNA的稳定性 2、将细菌生长与外源基因的表达在时间上分开：减轻细胞的代谢负荷 3、采用不同措施提高表达蛋白的稳定性：表达融合蛋白；采用某种突变菌株；表达分泌蛋白； 二、真核表达系统 利用真核细胞作宿主表达系统的优点是： ① 真核细胞能够识别和除去外源基因中的内含子，剪接加工形成成熟的mRNA。 ② 真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌表达的蛋白是没有糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫原性影响很大。 真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问题： ① 选择标记及选择系统只有少数几个； ② 转化效率低，一般只有10-6～10-4； ③ 外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一定的自发性和盲目性，整合的拷贝数和位置都还不能控制； ④ 细胞培养及细胞的挑选要求比较高，手续繁琐费时。此外，细胞大量培养还有不少问题，而且成本较高，利用培养细胞方式大量生产某些表达蛋白，从工艺到成本都要很好地考虑。 受体菌条件： 安全宿主菌