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基因定点突变技术 袁莎 定点突变 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 基因的体外定向突变 在DNA水平上产小多肚编码顺序的特异性改变称为基因的定向诱变。利用这项技术一方面可对某些天然蛋白质进行定位改造．另一方向还可以确定多肽链中某个氨基酸残基在蛋白随结构坟功能上的作用．以收集有关氨基酸残基线件序列与其空间构象及生物活性之间的对应关系．入设汁制作新则的突变蛋白提供理沦依据。 基因突变技术 1 局部随机掺入法 2 碱基定点转换法； 3 部分片段合成法 4 引物定点引入法 5 PCR扩增突变法 局部随机掺入法 将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒的特定位点上,其上游紧接着两个酶切位点RE1和RE2,它们分别能产生5’和3’突出的单链就性末端。用大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)末端特异性降解经RE1和RE2双酶切开的重组质粒3’凹端，并通过酶解反应时间控制新生成的单链区域大小(单链区域越短，突变精度越高)。终止反应后，单链区域用Kle-now酶补平，随后再用S1核酸酶处理单链末端，并以T4DNA连接酶连接成环。重组分子转化大肠杆菌，在体内复制过程中，由于类似物的碱基配对非特异性。50％的扩增产物分子内部引入了错配碱基，并导致位点突变。由这种方法产生的突变体一般合有几对取代碱基，而突变的区域则取决于外切酶Ⅲ末端降解的程度。 碱基定点转换法 能导致碱基定点转换的最简单方法是使用某些化学试剂在体外诱变DNA分子。通常将质粒DNA或待突变DNA片段用诱变剂处理后，转化大肠杆菌，构建突变体文库。最常见的体外诱变剂为亚硫酸氢钠，在DNA单链的情况下，它能特异性地使胞嘧啶残基脱氨形成尿嘧啶残基。处理后的DNA单链再由DNA聚合酶体外转化为双链结构，在复制过程中，原DNA分子上的CG碱基对便转换成TA碱基对。 从表面上看这种方法所引入的突变并非定点，但如果合适地控制诱变剂的处理条件，便能做到每个DNA单链分子只含单一转换的碱基，而且其位点随机分布，这样即可在样本庞大的突变体文库中挑选出在期望位点上突变的重组分子。 除了上述化学诱变外，还可以借助于酶促合成对DNA分子进行所有可能的碱基对转换。其原理是使单链DNA在不理想的反应条件下进行体外复制，如较高或较低的离子强度、不平衡的四种核苷酸底物浓度以及缺少从3’至5’核酸外切活性的DNA聚合酶（Taq）等。在体外DNA聚合反应系统中，如果某种核苷酸底物浓度过低，当模板要求该底物时便有可能为其它三种底物所取代，从而导致序列突变。 部分片段合成法 如果在待突变的位点上下游含有合适的限制性内切酶识别序列，尤其当多个待突变位点集中分布在该区域时，可考虑直接化学合成这一片段，在此过程中将欲突变的碱基设计进去，然后以此人工合成的寡聚核苷酸片段置换重组质粒上对应的待突变区域，即可完成基因的定点突变。部分片段合成法特别适用于系统改变功能蛋白的氨基酸序列，并在体内观察突变位点对蛋白质生物功能的影响，从而确立突变前这些氨基酸残基对蛋白质结构和功能的贡献。例如，在大肠杆菌噬菌体433和P22阻遏蛋白分子中，α-螺旋-转角-α螺旋结构域与操作子DNA的结合特性就是用上述方法研究的。 此外，如果上述用于置换的叫A片段来自另一种蛋白质的功能编码区，便可依照同样的程序获得集多种异源功能于一体的融合蛋白(或嵌合蛋白)；如果以人工合成的多种寡聚核昔酸随机序列(序列可达104-106种)作为置换片段，则可创建出在局部区域或位点高度离散的突变文库，再辅以适当的高通量筛选方案，员终获得结构和功能达到理想要求的蛋白变体，这种方法称为盒式突变技术。 引物定点引入法 若要在DNA特定位点上插入或缺失一段，也可设计合成特殊结构的寡聚核苷酸引物，并将之引入待突变区域。但须注意的是欲插入或缺失的DNA片段应小于引物本身的长度，否则退火操作相当困难。 PCR扩增突变法 将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒上，重组分子分在含有两种不同引物的反应管A和B中。在A管内，引物I与克隆基因的区域互补，并含有唯一一个错配碱基（即突变位点），引物II则与载体区域完全互补，使得两个引物的末端位于待突变位点的右侧；在B管内，两个引物均与克隆基因互补，但引物III含有一个错配碱基，引物IV则完全互补，两个引物的末端位于待突变位点的左侧。经若干轮PCR扩增反应后，积累的双链DNA产物均为线型平头分子。将A、