基因工程3精品.pptVIP

第二章 基因工程（3） 学习目标 1、掌握基因工程的原理和过程 2、了解基因工程在工农业、医药卫生等的应用 3、了解基因工程产品和食品的可能潜在风险 一、基因工程技术路线 DNA片段的取得（目的基因的分离和制备） DNA片段和载体的连接——重组体DNA 外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库 筛选与鉴定克隆子（目的基因） 目的基因表达 基因工程基本操作过程 （一）DNA片段（目的基因）的获得 目的基因含义： 指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。 获得目的基因的方法： 内切酶切割分离法、构建基因组文库或cDNA文库分离法、PCR扩增法和人工合成法. （二）DNA片段和载体的连接——重组体DNA 1、载体的选择和构建 如质粒、温和噬菌体等，最常用的还是质粒载体（能在宿主内高拷贝复制，具有多个酶切位点及有标记性基因等）和它的人为构建高表达载体（加入了细菌和病毒的强启动子 选择：根据实验的目的来选择。如果要获得大量的高纯度的DNA片段，则选具有高拷贝的质粒载体：colE1、pMB1、pMB9等松弛型复制子质粒。 2、基因重组 含义：（也叫DNA体外重组）利用限制性内切酶和其他的一些酶类，切割、修饰载体DNA和目的基因，将两者连接起来，使目的基因插入可以自我复制的载体内，通过转入受体细胞，使这种外源性的目的基因在受体细胞中得到正确表达。 即重组体DNA：载体DNA+引入的DNA 载体DNA和目的基因连接方法：按DNA片断末端的性质不同分为：粘性末端连接法、平整末端连接法、 DNA片断末端修饰后进行连接、 DNA片断 加 连杆后连接。 3、 DNA重组类型 （三）重组体DNA引入受体细胞 受体:原核生物细胞、真核生物细胞 原核生物细胞：大肠杆菌 真核生物细胞：酵母 导入方法：目前有很多种方法，但采用哪一种应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定 三）重组体DNA引入受体细胞导入方法： 1、外源DNA转化法：通过生物学、物理学、化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。 如果外源DNA分子是病毒（噬菌体）的DNA或RT-DNA，则将此过程称为转染。 适用：用于微生物细胞基因导入的有直接转化法、化合物诱导转化法、接合转化法、电穿孔转化法等；用于植物细胞基因导入的有微弹轰击转化法、激光微束穿孔转化法等。 三）重组体DNA引入受体细胞导入方法： 2、病毒（噬菌体）颗粒转导法：用病毒（噬菌体）DNA（或RT-DNA）构建的克隆载体或携带目的基因的克隆载体，在体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞，将此过程称为病毒（噬菌体）颗粒转导法。 适用：主要用于构建基因文库和动物的转基因 （四）筛选与鉴定克隆子（目的基因） 基本概念： 克隆子：通常将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称克隆子，也叫转化子。 重组子：含重组DNA分子（含目的基因）的克隆子称重组子。 克隆子的筛选方法： 1、根据载体选择的标记基因筛选转化子 方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。 1、根据载体选择的标记基因筛选转化子 抗药性标记插入失活选择法 根据载体除草剂抗性基因 β-半乳糖苷酶显色反应选择法 根据生长调节剂非依赖型筛选转化子 根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选 2、根据报告基因筛选转化子 报告基因： 一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。 由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。 条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏度高的基因。如：gus 葡醛糖酸酶基因，Lus荧光虫荧光素酶基因， Gfp绿色荧光蛋白基因 3、根据形成噬菌斑筛选转化子 转导受体菌，在培养基上形成噬菌斑，未转导的受体菌继续正常生长。 重组子的鉴定： 1、据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据重组DNA分子大小鉴定重组子。最基本、最简单的方法，但只能初步鉴定 据酶切图谱鉴定重组子 PCR扩增 DNA杂交法鉴定 应用DNA芯片鉴定重组子 据核苷酸序列鉴定重组子 DNA杂交法鉴定重组子 转化子的 总DNA 经 变性处理 成为单链DNA分子，用预先根据待检测的重组DNA分子制备的DNA探针与其杂交，进一步根据标记物检测杂交的DNA片段，出现阳性杂交的转化子就是预期的重组子。 探针（