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基因打靶 QQ:947645776 目录 一、简介 二、什么是基因打靶 三、优点 四、基因打靶的原理 五、基因打靶步骤 六、基因打靶技术的应用 一、简介： 在历经近20年的推广和应用后, 基因打靶技术终于获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。 2007年10月8日, 美国科学家卡佩奇和史密斯、英国科学家埃文斯因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。基因打靶技术的发明和应用革命性地改变了现代生物医学研究的面貌, 并导致了生物医学研究各个领域中的许多突破性进展。 三巨人 卡佩奇在哈佛时就是一位成果丰富的研究者，他发现了导致蛋白合成的分子机制。当他于1973年在犹他大学建立实验室时，便试图将分子基因学引入到对动物细胞的研究，以便获悉如何掌控这些细胞里的基因。卡佩奇于1977年开始一系列实验室研究，这些研究展现了对动物细胞进行基因打靶的技术，并在1989年成功对一只老鼠进行基因打靶。 Mario R. Capecchi 史密斯1925年出生在英国，后获得美国国籍。史密斯1951年获得牛津大学生物化学博史密斯和卡佩基几乎同时对“基因靶向”技术做出了奠基性贡献。他目前的研究方向主要集中在两个方面：一是对异形基因进行修正，另外一个便是利用人类基因病变构造动物模型，以发现新的疾病治疗方法。多年来，奥利弗-史密西斯教授及其助手深入研究了“基因打靶”的具体操作方法，并借助这项技术治疗地中海贫血症。 Oliver Smithies 埃文斯1941年出生在英国，1963年从剑桥大学毕业后，进入伦敦大学学院学习，获得解剖学和胚胎学博士学位。1978年，他返回剑桥大学工作。3年后，他和同事从小鼠胚胎中第一次成功分离出未分化的胚胎干细胞。这为“基因靶向”技术提供了施展本领的空间。如今，埃文斯在英国加的夫大学担任哺乳动物遗传学教授。 Sir Martin J. Evans 二、什么是基因打靶？ ①基因打靶（gene targeting）是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。 ②建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。 三、优点： ① 基因打靶所适应的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞； ②基因打靶能把外源基因引入染色体DNA 的特定片段上； ③在设计合理的情况下．基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造; ④基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA 的复制而稳定复制。 四、基因打靶原理 进行基因打靶，首先要设计和合成一个将要导人靶细胞的靶载体(targeting vector)。该载体不仅含有需要插入的DNA序列，其两端还含有与靶基因座上的序列相同的核苷酸片段．即同源重组指导序列。将此载体用基因转移的方法导人靶细胞．通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组(homologous recombination，HR)，使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的基因座上。 生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。 同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。 基因打靶的原理 五、基因打靶的主要步骤 1. 重组基因载体的构建 2. 转化受体细胞 3. 筛选 4. 鉴定 1.重组基因载体的构建 把目的基因和同源重组指导序列重组到带有标记基因的载体上。基因同源重组的发生依赖于同源序列的长度，目前认为3O～40bp的同源序列长度将是发生同源重组的保险线，重组率与同源序列长度呈正比，一般情况下同源重组指导序列为基因组DNA．而不用cDNA，以免造成基因组缺失或其他改变。 基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等。 基因打靶载体类型： ①基因插入型载体(Gene-insertion vector)：插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。 ②基因置换型载体(Gene—replacement vector)：置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。