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基因敲除 主要内容 一 、基因敲除概述 二 、基因敲除原理和方法 三 、基因敲除发展历程 1.基因敲除概述 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．基因敲除原理和方法 2.1. 利用基因同源重组进行基因敲除 利用Cre／LoxP实现靶基因的切除 2.2 利用随机插入突变进行基因敲除 2.3 RNAi引起的基因敲除 3.基因敲除发展历程 * * 2007年诺贝尔生理学医学奖 基因敲除 2007诺贝尔生理学医学奖获得者 英国人马丁·埃文斯、美国人马里奥·卡佩基和奥利弗·史密斯（从左至右），因为他们在改造活体内特定基因的“基因靶向”技术等方面做出的奠基性贡献，而共同获此殊荣。 2.1 利用基因同源重组进行基因敲除 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型 2.1.2条件性基因敲除法 2.1.3 诱导性基因敲除法 2.2利用随机插入突变进行基因敲除。 2.3.RNAi引起的基因敲除。 2.4实现基因敲除的其他原理。 除上述几种已经比较成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，还有一些基于其他原理的敲除技术正处于研究和完善过程中，如TFOs（Triple helix forming oligonucleotides）引导的基因敲除术[16]以及反义技术在基因敲除技术中的运用等。 1．基因载体的构建 2．ES 细胞的获得 3．同源重组 4. 选择筛选已击中的细胞 5．表型研究 6．得到纯合体 2.1. 1 利用同源重组构建基因敲除动物模型 2.1. 2 条件性基因敲除法 定义:将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。 它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。 条件性基因敲除的基因重组及切除步骤 2.1. 3诱导性基因敲除法 诱导性基因敲除是利用控制CRE表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将表达系统转移到动物体内的过程在时间的可控性，从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修之目的的基因敲除技术 此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 在此方法下，还出现了一种新的方法：基因捕获法 由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除. RNAi基因敲除的应用 1. 研究信号传导通路的良好工具 2. 研究在发育过程中起作用的基因 3.体外培养的细胞中研究一些小鼠在胚胎时就会死亡的基因的功能 1.基因敲除的技术基础：80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功 2. 基因敲除的理论基础：1985年，首次证实的 哺乳动物细胞中同源重组的存在 3. 80年代后半期，DNA同源重组原理发展起来诞生了基因敲除这样一门新技术。 4.到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。 5.直到现在，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。 *