凡纳滨对虾虾头源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究.pdf

凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究 摘要 虾头是去头虾、虾仁等产品加工过程中的副产物，全国年产虾头约20万吨，其 中凡纳滨对虾虾头占70％。虾头不仅含有丰富的蛋白质等营养成分，还含有丰富的内 源蛋白酶，这些蛋白酶在一定条件易导致虾头发生自溶作用，造成虾头腐烂变质，致 使虾头得不到高值化利用，这不仅造成了资源的浪费，而且带来了严重的环境污染。 为了深刻认识虾头内源酶的特性，有效保持虾头贮藏过程中的品质，充分利用虾 头内源蛋白酶廉价回收虾头蛋白等营养成分提供基础数据，本论文首先研究了虾头内 源蛋白酶活性随pH的变化规律，确定了虾头中存在两类内源性蛋白酶，其最适pH 分别为2．0和8．0，在此基础对两类内源性蛋白酶的提取纯化和酶学特性进行了系统 研究，并采用液相．质谱联用技术对这两种蛋白酶的同源性进行了初步分析，主要研 究结果如下： l、以温度、pH和料液比等单因素对儿纳滨对虾虾头内源性蛋白酶活性影响结果 为基础，采用正交实验对凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶最佳提取工艺条件进行了优 化，并对两类内源蛋白酶硫酸铵分级沉淀的最佳饱和度进行了研究。结果表明：酸性 蛋白酶最佳提取条件为缓冲溶液pH3．0，料液比l：2，温度30℃。酸性蛋白酶硫酸铵 一级沉淀的饱和度为10％，硫酸铵二级沉淀饱和度为50％；碱性蛋白酶最佳提取条 件为缓冲溶液pH8．0，料液比l：3，温度50℃。碱性蛋白酶硫酸铵一级沉淀饱和度为 20％，硫酸铵二级沉淀饱和度80％。 E G．150凝胶过滤层对凡纳 2、采用Q．SepharoseF阴离子交换层析和Sephadex 滨对虾虾头内源碱性蛋白酶进行了纯化，并用SDS．PAGE对纯度与分子量进行了评 得率为32．8％，分子量为79．95kDa。 F．F阴离子交换层析对凡 G．100凝胶层析和DEAE．Sepharose 3、采用Sephadex 纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶进行了纯化，并用SDS—PAGE对纯度与分子量进行了 评价。结果表明，纯化得到电泳纯级的内源酸性蛋白酶，其比活为698．09U／mg，纯 化倍数达到15．7倍，得率为20．20％，分子量为27．45kDa。 4、凡纳缤对虾虾头内源碱性蛋白酶酶学特性研究结果表明，该酶最适pH和最 和7．1199／min，金属离子Fe3+、Mn2+、H矿，TryPsininhibitor均能完全抑制其活性， DTT对其有激活作用，该蛋白酶属于胰蛋白酶酶类。 5、凡纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶酶学特性研究结果表明，该酶最适pH和最 A和EDTA均能完全抑制其 分别为2．01rdL和26．39I．tg／min，金属离子H矿，Pepstatin 活性，Ca2+对其有激活作用，该酶属金属蛋白酶，性质类似于胃蛋白酶类。 6、采用分子荧光法和傅罩叶红外光谱法研究了儿纳缤对虾虾头两类内源蛋白酶 白酶随着pH和离子强度的增大荧光强度上升，但荧光发射峰的位置并未发生移动， 辨率为为4cmd条件下，两种内源性蛋白酶红外光谱都呈现出a．螺旋和p一折叠的特征， 但两类蛋白酶谱带数据有所差异。 分析，将检测到两种内源性蛋白酶的部分氨基酸序列分别与不同物种的胰蛋白酶和胃 NTIsuite 蛋白酶氨基酸序列于Vector 8．0软件上进行序列比对，结果表明，发现凡纳 滨对虾虾头内源碱性蛋白酶与猪的胰蛋白酶具有很高的同源性，均含有氨基酸序列 具有很高的同源性，均含有氨基酸序列EFGLSETEPGTNF。 关键词：凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶，分离纯化，酶学特性，同源性分析 II Purificationof ProteasesFrom Endogenous Head VannameO