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凡纳滨对虾过敏原活性评价及其抗原决定簇的初步表征 摘 要 随着现代生物技术的发展和国际食品贸易的日益扩大，食物过敏问题日益严 重。为了更好的预防和控制食物过敏的发生，有关过敏原的评价和相关的机理研 究成为急需解决的问题。目前FAO／WHO颁布的食品过敏原树状评估体系还有待 完善，尤其是动物模型评价环节，现在还没有标准的动物模型和统一的评价方法。 本文以虾过敏原(八大类容易引起过敏的食物之一)为代表建立系统的过敏模型， 旨在构建接近人体过敏情形、经济、实用的动物评价模型，并对现有评价系统进 行发展和完善。为了从机理上探讨过敏的机理，本论文还结合生物信息学手段对 虾过敏原的抗原表位进行研究，对表位的一些特征进行了初步的表征。 1、通过系统暴露方式建立了BALB／c小鼠致敏模型。结果表明，皮下注射是 较优的致敏方案可使小鼠产生较高的抗体滴度，被动皮肤致敏实验检测IgE效价 可达到32，但是皮下注射、腹腔注射两种系统暴露途径均可导致BALB／c小鼠 假阳性的评价结果。这两种系统暴露途径造成小鼠产生假阳性致敏率达10％～ 30％。 2．首次采用持续单纯口服虾过敏原(Pena1)的方法成功建立了虾过敏的 BALB／c小鼠模型。该模型对Pena1有特异性免疫应答，对非致敏蛋白PAP无免 疫应答，特异性良好，无假阳性结果的出现，该模型在免疫应答上表现灵敏，致 敏率达到80％，抗原消耗量低，完全符合口服暴露途径建立的动物模型的标准。 3．首次尝试构建具有过敏体质的小鼠评价模型，结果表明，仔鼠的过敏体质 和亲代鼠的致敏状况无关，IgE抗体并没有通过亲代鼠而感染仔鼠；但是在胚胎 后期的抗原暴露会导致仔鼠产生过敏体质，成功率约为40％。这种利用食物过敏 原在母鼠妊娠期进行干扰来刺激小鼠免疫系统的方法，可有效的使仔鼠的IgE抗 体滴度、淋巴细胞增殖率、细胞因子水平较正常小鼠产生明显的统计学差异，该 类小鼠成年后对过敏原的后天刺激有明显的易感倾向。 4．首次利用BALB／c小鼠腹腔内的肥大细胞初步建立了评价过敏原致敏活性的 体外模型。通过模拟体内的生理环境实施肥大细胞脱颗粒实验的结果表明，肥大 al 细胞在体外可实现特异性释放，释放率与IgE抗体滴度之间存在一致性，Pen 在10．100ng／m范围内肥大细胞可以呈现剂量依赖性释放。 a 5．运用体外模拟胃肠液消化模型评价的Pen1在胃肠液消化的过程中分解成了 33kd、23kd、14kd的蛋白质片段，这些酶解片段在消化液中可以稳定存在达l a1的 小时以上且均有致敏活性。在反应进行到60分钟时，胃液和肠液中的Pen 致敏活性仅降到了45％和30％。 a 6．在国内外首次利用生物信息学方法预测Penl的抗原表位，得到了9个可 a 能的抗原决定簇位点，它们分别位于Pen1的40—48、5卜63、75—86、136—150、 8 种预测方法预测了Pen1的二级结构与蛋白质表面特性，并对多个指标进行 综合分析，基本构建了预测过敏原B细胞结合位点的一个分析预测体系。 7．对预测所得的抗原表位进行了合成与活性鉴定，鉴定的结果表明HY～1、HY一2、 a ella1表面 抗原决定簇在Pen1上暴露情况的检测结果表明6条活性抗原肽在P 均有分布，HE4、、HY-9的肽段上可能存在多个IgE结合位点并有部分表位可能 a 隐藏。Penl上抗原表位均具有较强的抗微波的能力，其中HY4～HY-9肽段 上的表位抗微波能力最强，在微波达到10min时仍保持微弱的致敏活性，怀疑与 a1抗加工的 其独特的立体结构有关，这些表位的特性在一定程度上揭示了Pen 内在机理。 综上所述，通过系统暴露途径