生物修复作用菌的竞争PCR检测方法的建立及其应用.pdfVIP

生物修复作用菌的竞争pCR检测方法的建立及其应用 摘 要 传统的依靠培养基进行培养、分离、生化鉴定及计数的微生物研究方法，操 作繁琐、检测周期长，已远远不能满足人们对微生物快速、特异、简便、敏感且 低耗的快速检测及研究的要求。近年来，微生物的快速检测和自动化研究进展迅 速。快速检测及其自动化已深入到分子水平，利用核酸杂交、抗原抗体反应等对 微生物进行分离、检测、鉴定和计数，使微生物的检测更为灵敏、快速、准确、 方便。 conUol 板(tutemal 并通过电泳使扩增产物在凝胶上明显分开，从而进一步进行定性或定量分析。竞 争PCR能消除管间及样本间的变异，定量范围较广，能够检测2倍的差异。且 此方法不需要昂贵的仪器设备，实验条件容易达到。因此本论文选用竞争PCR 建立了海水养殖环境生物修复作用细菌的快速定量检测方法。 竞争PCR定量方法的关键是内标，内标设计成功与否直接影响竞争PCR反 应。本文通过将细菌特定DNA片段经双酶切缺失中间-d,片段。将余下的2个 较大片段连接，并用相同的引物在相同条件下扩增连接产物，从而获得截短的同 源性片段，作为内标。制备时，将其纯化后克隆子pMDl8．T载体，重组质粒经 酶切和PCR鉴定，验证无误后