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2015-9-22 Gel Shift Assay Contents 1. Introduction 2. Principle 3. Application 4. Materials 5. Procedure 6. Proof of Specificity Principle DNA-protein complexes migrate slower than non-bound DNA in a native polyacrylamide or agarose gel, resulting in a “shift” in migration of the labeled DNA band. Application Materials 3 or 5 end-labeled DNA target. Protein extract unlabeled DNA target Polyacrylamide gel in 0.5X TBE Electrophoresis apparatus Positively charged nylon membrane Electroblotter transfer apparatus UV lamp X-ray film Prepare the Probe Plan Binding Reactions Procedure 1. Prepare nuclear protein extracts 2. Prepare Biotin- labeled and unlabeled target DNA 3. Plan Binding Reactions 4. Prepare and Pre-Run Gel 5. Prepare and Perform Binding Reactions 6. Electrophorese Binding Reactions 7. Electrophoretic Transfer of Binding Reactions to Nylon Membrane 8. Cross-link Transferred DNA to Membrane 9. Detect Biotin-labeled DNA by Chemiluminescence Proof of Specificity Chromatin immunoprecipitation Used to determine whether a given protein binds to a given DNA sequence in vivo Like all protein analysis involving antibodies (including westerns) a specific antibody is required If there is no specific antibody, then epitope tagging can be employed (FLAG, MYC, HIS) * * 启动子活性分析 基因表达调控的研究策略和常用方法 基因表达调控是多层次的复杂过程 启动子（Promoters） 是位于结构基因5‘端上游的DNA序列，其长度从100 bp到200 bp不等，与转录起始时RNA聚合酶识别、结合和启动转录有关。 启动子控制基因转录的起始时间和表达的程度。 启动子的组成 promoter 普遍转录因子 启动子活性分析 Reporter Assay EMSA ChIP Reporter Assay promoter structural gene promoter reporter gene 报告基因 (reporter)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。 （1）已被克隆和全序列已测定； （2）表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物； （3）其表达产物能进行定量测定。 （一）氯霉素乙酰转移酶基因（CAT） 可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。 线性范围较窄，灵敏性较低 （二）β半乳糖苷酶 由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。 （三） 荧光素酶（Luciferase） 是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称。荧光的产生是来自于荧光素（底物）的氧化，哺乳细胞无内源性荧光素酶。 最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽，是最常用于哺乳细胞的报告基因。 （四）荧光蛋白家族：GFP, BFP,RFP promoter luc 荧光素酶报告基因检测 缺失（deletion）