环介导等温扩增术快速检测蜡样芽孢杆菌研究.pdfVIP

摘要 蜡样芽孢杆菌是引起食物中毒的常见致病菌之一，食物暴露2h以上极易受污染，引起食 物中毒的食品多为乳制品，米饭等蛋白质含量多的食品。目前，国内检测食品中蜡样芽孢杆 菌仍采用传统的方法，其操作繁琐，检测时间长，通常需要3～5d。本研究建立了一套用LAMP 技术快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，缩短了检测时问，提高检测方法的灵敏性。 isothermal 环介导等温扩增技术(Loop．mediated NOTOMI发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点， 成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)在环境中广泛存在， 极易污染食品及食品原料，并且耐高温不易被杀死，可以产生导致呕吐和腹泻两种类型的食物 中毒。因此，建立LAMP快速检测蜡样芽孢杆菌的方法对于控制蜡样芽孢杆菌的食物中毒具有重 要意义。 accessionnumber 本研究针对蜡样芽孢杆菌的特异基因hbld(GenBank AJ237785)设计引物， 用LAMPiJI物在线设计引物软件设计引物，对内引物浓度、外引物浓度、M92+浓度、甜菜 碱浓度、BST酶浓度等反应条件进行了优化，建立LAMP反应体系。 内引物)40 mmoFLdNTP，1．0mmoFLBetaine， pmol／I-tL：其它反应组分终浓度分别为：1．0 mM mlVl 6．0mmol／L KCI，10mM MgS04，2．5I．tLBst酶缓冲液(20 Tris-HCl(pH8．8，250C)，10 HlM (NH4)2S04，2 MgS04，O．1％．TritonX-100)，llxL(8LDBst大分子聚合酶，l灿目标DNA， 纯水补足体积到25I．tL。扩增反应条件为62℃保存1h，80122min使酶灭活。 FTA卡是用螫合剂和变性剂浸泡过的纤维基质，他可以在接触微生物时将其吸附并裂解细 LAMP方法相结合，检测蜡样芽孢杆菌。 对LAMP快速检测蜡样芽孢杆菌的方法进行了评价，测定了其检出限，特异性，敏感性，符 合率，并与PCR检测方法进行了对比。尝试了在反应产物中加入EB，在紫外灯下快速观测反应 增最短可在20min内完成，对消毒乳中蜡样芽孢杆菌的检测的整个检测过程(包括DNA提取1h、 测方法，该方法灵敏度高、特异性好、耗时短，为食品中蜡样芽孢杆菌快速检测构建了一个技术 平台。 方法敏感性为100％：特异性为72．7％，符合率为94．5％。 关键词：环介导等温扩增；核酸；链置换反应；LAMP．蜡样芽孢杆菌；消毒乳 DetectionofBacilluscereus Isothermal Rapid UsingLoop-MediatedAmplification Zhe Author：Qi and of agriculture Major：processingstorage production Wei Supervisor：ProfessorZhang Abstract· BacilluscereusisawidesPreadbacter